3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए कैनाइन आंतों और यकृत ऊतकों से वयस्क स्टेम कोशिकाओं की कटाई के लिए प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, लगातार विकास सुनिश्चित करने और फसल, बायोबैंक, और कैनाइन आंतों और यकृत ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को पुनर्जीवित करने के लिए मानक संचालन प्रक्रियाएं प्रदान करने के लिए प्रयोगशाला तकनीकों पर चर्चा की जाती है।
कुत्तों में मनुष्यों के अनुरूप जटिल मल्टीफैक्टोरियल बीमारियां विकसित होती हैं, जिनमें भड़काऊ रोग, चयापचय रोग और कैंसर शामिल हैं। इसलिए, वे मानव चिकित्सा के लिए ट्रांसलेशनल क्षमता के साथ प्रासंगिक बड़े पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ऑर्गेनोइड्स 3-आयामी (3 डी), स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न स्व-इकट्ठे संरचनाएं हैं जो उनके मूल अंग के माइक्रोएनाटॉमी और शरीर विज्ञान की नकल करती हैं। इन ट्रांसलेशनल इन विट्रो मॉडल का उपयोग दवा पारगम्यता और खोज अनुप्रयोगों, विष विज्ञान मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है, और मल्टीफैक्टोरियल पुरानी बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी की यांत्रिक समझ प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, कैनाइन ऑर्गेनोइड्स साथी कुत्तों के जीवन को बढ़ा सकते हैं, पशु चिकित्सा अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में इनपुट प्रदान कर सकते हैं और पशु चिकित्सा में व्यक्तिगत उपचार अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। दाताओं का एक छोटा समूह ऑर्गेनोइड नमूनों का एक बायोबैंक बना सकता है, जिससे निरंतर ऊतक कटाई की आवश्यकता कम हो जाती है, क्योंकि ऑर्गेनोइड सेल लाइनों को अनिश्चित काल तक उप-सुसंस्कृत किया जा सकता है। इसमें, तीन प्रोटोकॉल जो वयस्क स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न आंतों और यकृत कैनाइन ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति पर ध्यान केंद्रित करते हैं, प्रस्तुत किए जाते हैं। कैनाइन ऑर्गेनोइड आइसोलेशन प्रोटोकॉल ऊतक को संसाधित करने और एक सहायक मैट्रिक्स (घुलनशील बाह्य कोशिकीय झिल्ली मैट्रिक्स) में सेल आइसोलेट के एम्बेडिंग के तरीकों को रेखांकित करता है। कैनाइन ऑर्गेनोइड रखरखाव प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड विकास और रखरखाव का वर्णन करता है, जिसमें विस्तार के लिए उचित समय के साथ सफाई और पासिंग शामिल है। ऑर्गेनोइड हार्वेस्टिंग और बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल आगे के विश्लेषण के लिए ऑर्गेनोइड्स को निकालने, फ्रीज करने और संरक्षित करने के तरीकों का वर्णन करता है।
कृन्तक बायोमेडिकल और ट्रांसलेशनल रिसर्च 1 के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडल हैं। वे बीमारियों के बुनियादी आणविक रोगजनन की जांच के लिए असाधारण रूप से उपयोगी हैं, हालांकि पुरानी मल्टीफैक्टोरियल बीमारियों के लिए उनकी नैदानिक प्रासंगिकता पर हाल ही में सवाल उठाया गया है2। कैनाइन मॉडल कृन्तकों 3,4 की तुलना में कई फायदे प्रदर्शित करता है। कुत्तों और मनुष्यों को मेटाबोलोमिक्स और आंतों के माइक्रोबायोम में समानताएं साझा होती हैं जो उनके पालतू जानवरों की विभिन्न अवधियों में मानव आहार की खपत के कारण विकसित होती हैं5,6,7। कैनाइन और मानव जठरांत्र संबंधी शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान के बीच समानताएं उदाहरणों में से एक हैं8।
इसके अतिरिक्त, कुत्ते अक्सर अपने मालिकों के साथ समान वातावरण और जीवन शैली साझा करते हैं। कृन्तकों की तुलना में कुत्तों का लंबा जीवनकाल कई पुरानी स्थितियों के प्राकृतिक विकास के लिए अनुमति देता है10। सूजन आंत्र रोग या चयापचय सिंड्रोम multifactorial पुरानी बीमारियों के उदाहरण हैं जो मनुष्यों और कुत्तों के बीच महत्वपूर्ण समानताएं साझा करते हैं11,12। कैनाइन प्रीक्लिनिकल परीक्षण जो स्वाभाविक रूप से होने वाली बीमारियों के साथ कुत्तों को शामिल करते हैं, कृंतक मॉडल 13 से प्राप्त लोगों की तुलना में अधिक विश्वसनीय डेटा उत्पन्न कर सकते हैं। हालांकि, जीवित पशु अनुसंधान के उपयोग को कम करने और 3Rs (Reduce, Refine, Replace) 14 के सिद्धांतों का पालन करने के लिए, 3 D इन विट्रो कैनाइन ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके विवो परीक्षण में विकल्प उभरे हैं15।
ऑर्गेनोइड्स स्व-इकट्ठे 3 डी स्टेम सेल-व्युत्पन्न संरचनाएं हैं जो अपने मूल अंगों के शरीर विज्ञान और माइक्रोएनाटॉमी को दोहराती हैं16,17। इस तकनीक को पहली बार 200917 में सातो एट अल द्वारा वर्णित किया गया था और उपकला सेल लाइनों में विट्रो अध्ययनों में अधिक अनुवाद योग्य के लिए अनुमति दी गई थी, जो पहले 2 डी कैंसर सेल संस्कृतियों 18,19,20 का उपयोग करके संभव था। Organoids कई बायोमेडिकल विषयों में विट्रो मॉडल में उपयोगी हैं जैसे कि प्रीक्लिनिकल टॉक्सिकोलॉजिकल 21,22,23, अवशोषण, या चयापचय अध्ययन24,25,26,27,28, साथ ही साथ व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण 29,30,31 में . कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड्स की सफल संस्कृति को 201912 में पहली बार वर्णित किया गया है, जबकि कुत्ते से व्युत्पन्न यकृत ऑर्गेनोइड्स को पहली बार 201532 में नंटासैंटी एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था। कैनाइन ऑर्गेनोइड्स का उपयोग कैनाइन क्रोनिक एंटरोपैथी, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर, कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा 12 और विल्सन रोग 33,34 की जांच करने वाले अध्ययनों में सफलतापूर्वक किया गया है।
जबकि वयस्क स्टेम कोशिकाओं को necropsies के माध्यम से काटा जा सकता है, ऑर्गेनोइड तकनीक को हमेशा जानवरों के बलिदान की आवश्यकता नहीं होती है। एंडोस्कोपिक और लेप्रोस्कोपिक बायोप्सी, या यहां तक कि अंगों के ठीक-सुई एस्पिरेट्स 35, उपकला ऑर्गेनोइड अलगाव 12 के लिए वयस्क स्टेम कोशिकाओं का एक व्यवहार्य स्रोत हैं। पशु चिकित्सा अभ्यास में इस तरह की गैर-आक्रामक तकनीकों का व्यापक उपयोग रिवर्स ट्रांसलेशनल अनुसंधान (पशु चिकित्सा नैदानिक अभ्यास से मानव नैदानिक अभ्यास और इसके विपरीत जानकारी का अनुवाद) के लिए विकल्पों की सुविधा प्रदान करता है। ऑर्गेनोइड प्रौद्योगिकी की आगे की प्रगति को ऑर्गेनोइड संस्कृति और रखरखाव विधियों के मानकीकरण द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल आंशिक रूप से 201536 से सक्सेना एट अल के पहले प्रकाशित काम पर आधारित है, और विधियों को कैनाइन आंतों और यकृत ऑर्गेनोइड संस्कृति की बारीकियों को फिट करने के लिए अनुकूलित किया गया था। कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल के समग्र वर्कफ़्लो को चित्र 1 में दर्शाया गया है।
कैनाइन ऑर्गेनोइड आइसोलेशन प्रोटोकॉल एंडोस्कोपिक, लेप्रोस्कोपिक और सर्जिकल बायोप्सी, साथ ही नेक्रोप्सी से नमूने प्राप्त करने के तरीकों का परिचय देता है। यह ऊतक के नमूनों और प्रयोगशाला में परिवहन के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों के प्रारंभिक पूर्व-उपचार की रूपरेखा तैयार करता है। ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए आवश्यक सामग्री और अभिकर्मकों को ‘अलगाव की तैयारी’ अनुभाग में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। ऊतक के नमूनों से वयस्क स्टेम सेल अलगाव की प्रक्रिया को आगे विस्तार से वर्णित किया गया है। अंत में, एक घुलनशील बाह्य कोशिकीय झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करके गुंबद जैसी संरचनाओं में ऑर्गेनोइड्स चढ़ाना की प्रक्रिया पर चर्चा की जाती है।
दूसरा प्रोटोकॉल, कैनाइन ऑर्गेनोइड रखरखाव प्रोटोकॉल, ऑर्गेनोइड्स के दस्तावेजीकरण और खेती के तरीकों का वर्णन करता है। मीडिया परिवर्तन और उनकी आवृत्ति पर इस अनुभाग में चर्चा की गई है। इसके अलावा, प्रयोगशाला प्रक्रियाओं जैसे कि कोशिका संस्कृतियों को पास करना और साफ करना, जो 3 डी कैनाइन ऑर्गेनोइड्स के सफल रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं, का वर्णन किया गया है। उपयुक्त पासिंग प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम है, और इस चरण के संभावित समायोजन और समस्या निवारण पर पांडुलिपि में आगे चर्चा की गई है।
अंतिम प्रोटोकॉल कैनाइन ऑर्गेनोइड हार्वेस्टिंग और बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल है जिसमें पैराफिन-एम्बेडिंग और आरएनए संरक्षण के लिए पूर्ण विकसित ऑर्गेनोइड्स तैयार करने के तरीके शामिल हैं। तरल नाइट्रोजन भंडारण में बायोबैंकिंग ऑर्गेनोइड नमूनों के तरीकों का भी यहां वर्णन किया गया है। अंत में, जमे हुए नमूनों को पिघलाने और उनके विकास का समर्थन करने के तरीकों पर चर्चा की जाती है।
अंत में, इस लेख का उद्देश्य अंतर-प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के मानकीकरण के माध्यम से सुसंगत कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रक्रियाएं प्रदान करना है। ऐसा करने में, पांडुलिपि का उद्देश्य कैनाइन ऑर्गेनोइड मॉडल से प्राप्त डेटा की पुनरुत्पादकता को सुविधाजनक बनाना है ताकि ट्रांसलेशनल बायोमेडिकल रिसर्च में उनकी प्रासंगिकता को बढ़ाया जा सके।
चित्रा 1: कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो. कैनाइन ऑर्गेनोइड आइसोलेशन प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए आवश्यक सामग्रियों की तैयारी का वर्णन करता है, एक ऊतक के नमूने की कटाई (नेक्रोप्सी, एंडोस्कोपिक, लेप्रोस्कोपिक और सर्जिकल बायोप्सी के माध्यम से), और सेलुलर आबादी के सेल पृथक्करण और चढ़ाना पर मार्गदर्शन। कैनाइन ऑर्गेनोइड रखरखाव प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड संस्कृति की सफाई और पासिंग पर चर्चा करता है। ऑर्गेनोइड हार्वेस्टिंग और बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल पैराफिन-एम्बेडिंग और आगे ऑर्गेनोइड लक्षण वर्णन के लिए ऑर्गेनोइड नमूनों की तैयारी पर चर्चा करता है। बायोबैंक ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के तरीकों और तरल नाइट्रोजन में भंडारण से उन्हें पुनर्जीवित करने के तरीकों पर भी चर्चा की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वर्तमान में कैनाइन हेपेटिक और आंतों के ऑर्गेनोइड्स के अलगाव और रखरखाव के लिए उपलब्ध मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं की स्थापना इस मॉडल के लिए विभिन्न प्रयोगशाला सेटिंग्स में लागू होने के लिए वारंट की गई है। विशेष रूप से, इन कैनाइन ऑर्गेनोइड मॉडल की संस्कृति के लिए मानकीकृत ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रदान करना संस्कृति के दौरान ऑर्गेनोइड्स के सामान्य विकास की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण है और विस्तार और रखरखाव के लिए इष्टतम टाइमपॉइंट प्राप्त करने के लिए पासिंग है। प्रोटोकॉल का उपयोग करके सुसंस्कृत कैनाइन आंत्र ऑर्गेनोइड्स को पहले चंद्रा एट अल.12 की विशेषता है।
प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक ऑर्गेनोइड्स का पासिंग है। यकृत गोलाकार के पहले पारित होने के लिए इष्टतम समय यकृत गोलाकार माप के आधार पर अलगाव के बाद दिन 7 पर निर्धारित किया गया था। गोलाकार की अधिकतम मात्रा दिन 7 तक प्राप्त की गई थी, और एक ही समय में, गोलाकार ने कली करना शुरू कर दिया और यकृत ऑर्गेनोइड्स का गठन किया। अलगाव के बाद दिन 2-7 से समग्र ऑर्गेनोइड मात्रा में वृद्धि 365 गुना से अधिक थी, यह सुझाव देते हुए कि इष्टतम मार्ग समय कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृति की तुलना में अधिक है। संस्कृति में 7 दिनों के बाद, यकृत गोलाकार में सेलुलर एपोप्टोसिस के कोई सकल संकेत नहीं देखे गए थे, यहां तक कि सफाई या पासिंग के बिना भी (चित्रा 7)। आंतों और यकृत organoids passaging चुनौतीपूर्ण हो सकता है के रूप में प्रक्रिया कोशिकाओं के नुकसान और परिवर्तित व्यवहार्यता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. परिणामों से संकेत मिलता है कि ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज (12 मिनट तक) के साथ यकृत ऑर्गेनोइड्स की लंबे समय तक इनक्यूबेशन उपसंस्कृति को नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं करती है। 24 मिनट से अधिक समय तक ट्रिप्सिन-जैसे प्रोटीज में ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करना ऑर्गेनोइड्स के बाद के उपसंस्कृति के लिए हानिकारक हो सकता है।
ऑर्गेनोइड मार्ग के साथ सेल समूहों में सबऑप्टिमल टूटने के मामले में, ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन के बजाय यांत्रिक पृथक्करण अधिक फायदेमंद हो सकता है। यदि ऑर्गेनोइड्स के उचित पृथक्करण के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ता है, तो मार्ग उपज को बढ़ाने के लिए नमूनों के संक्षिप्त भंवर का प्रयास किया जा सकता है। दूसरी ओर, भंवर में एक संस्कृति को बर्बाद करने और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने की क्षमता होती है, इसलिए इसका उपयोग केवल तभी किया जाना चाहिए जब अन्य प्रक्रियाएं बार-बार विफल हो जाती हैं। एकल कोशिकाओं में यकृत ऑर्गेनोइड्स को तोड़ने से ऑर्गेनोइड्स की वृद्धि दर कम हो जाती है, जबकि उन्हें कोशिकाओं के समूहों में तोड़ने से उनकी व्यवहार्यता में काफी सुधार हो सकता है। दस मिनट ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल के लिए इनक्यूबेशन समय के रूप में चुना गया था। ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज प्रयोग में 24 मिनट के इनक्यूबेशन की तुलना में 12 मिनट इनक्यूबेशन टाइमपॉइंट को साइटोटोक्सिक नहीं माना गया था।
उत्तरजीविता प्रयोग ने पुष्टि की कि कैनाइन हेपेटिक ऑर्गेनोइड्स प्रतिकूल परिस्थितियों (संरचनात्मक और पोषण संबंधी कमी) में 19.5 दिनों तक जीवित रह सकते हैं। ऑर्गेनोइड्स जो इन स्थितियों से सबसे लंबे समय तक बच गए थे, उन्हें सीएमजीएफ + मीडिया के साथ सुसंस्कृत किया गया था। यह अवलोकन मीडिया में यकृत ऑर्गेनोइड्स की धीमी वृद्धि के कारण हो सकता है जो रॉक इनहिबिटर और जीएसके 3 के साथ पूरक नहीं है। सीएमजीएफ + आर / जी के साथ ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में तेजी से वृद्धि हुई है और उनके संसाधनों को तेजी से समाप्त कर दिया गया है। यह प्रयोग एक उच्च-थ्रूपुट सिस्टम रूपांतरण को प्राप्त करने के लिए कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति को छोटा करने की संभावनाओं को खोलता है। इस तरह की तकनीक काफी कम लागत पर दवा की खोज या विष विज्ञान अध्ययन को सुविधाजनक बनाने की क्षमता दिखाती है।
कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति रखरखाव के दौरान सामना की जाने वाली कुछ सामान्य समस्याएं अनुचित नमूना ठोसीकरण हैं जब चढ़ाना, संस्कृति संदूषण, और ऑर्गेनोइड्स के उचित घनत्व और आकार की स्थापना। यदि घुलनशील ईसीएम चढ़ाना के दौरान समय से पहले ठोस हो जाता है, तो तुरंत इसे 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। यदि घुलनशील ईसीएम गुंबद जैसी संरचनाओं का निर्माण नहीं करता है, तो यह संभावना है कि नमूने से पर्याप्त मीडिया नहीं हटाया गया था। यदि यह मामला है, तो गुंबदों के बनने तक नमूने को अधिक घुलनशील ईसीएम के साथ पतला करें।
जब एक पूरी प्लेट में कवक या जीवाणु संदूषण पाया जाता है ( चित्रा 4 देखें), तो सबसे अच्छा समाधान प्लेट को त्यागना है। एंटिफंगल या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार का प्रयास किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के प्रयास की सफलता बेहद कम है। यदि एक भी कुआं एक प्लेट में दूषित है, तो व्यवहार्य और अप्रभावित कुओं को एक नई प्लेट में साफ किया जा सकता है (चरण 4.1 से 4.5 का पालन करें) और बारीकी से निगरानी की जा सकती है। यदि नमूना पहले से ही आपातकालीन जमे हुए है, तो पूरे नमूने को त्यागने की सलाह दी जाती है, क्योंकि नमूने को पिघलाने से इनक्यूबेटर को अतिरिक्त संदूषण जोखिम में उजागर किया जाता है।
स्वस्थ ऑर्गेनोइड संस्कृति कम से कम मध्यम आकार और मध्यम घनत्व श्रेणी या उससे बड़ी होनी चाहिए। इष्टतम घनत्व ऑर्गेनोइड संस्कृति विकास के लिए महत्वपूर्ण है। कम घनत्व मध्यम घनत्व के लिए organoids सफाई द्वारा सही किया जाना चाहिए. यदि अत्यधिक घनत्व की स्थिति होती है (भीड़ भाड़), तो ऑर्गेनोइड्स को अधिक कुओं में विस्तारित किया जाना चाहिए। सेलुलर एपोप्टोसिस के सकल संकेत अक्सर ऑर्गेनोइड संस्कृति के भीड़-भाड़ और कम घनत्व दोनों के साथ होते हैं। यदि इन मुद्दों को समय पर ठीक नहीं किया जाता है, तो पूरे ऑर्गेनोइड संस्कृति कुछ ही दिनों में एपोप्टोटिक हो जाएगी। यदि ऑर्गेनोइड्स अतिरिक्त बड़े आकार या बहुत अधिक घनत्व प्राप्त करते हैं, तो संस्कृति का उपयोग प्रयोग, ठंड, या निर्धारण के लिए किया जाना चाहिए।
ऑर्गेनोइड मीडिया में वर्तमान में 17 घटक शामिल हैं, और ऑर्गेनोइड रखरखाव और विस्तार के लिए आवश्यक विकास कारकों के अलावा इसलिए महंगा हो सकता है। इस समस्या को 2 डी सेल संस्कृतियों को बढ़ाकर हल किया जा सकता है जो वातानुकूलित सीएमजीएफ + का उत्पादन करने के लिए विकास कारकों को संश्लेषित करते हैं। सेल संस्कृति L-WRN WNT-3a, R-Spondin-3, और Noggin विकास कारक37 का उत्पादन करता है। सेल कॉलोनी 90% DMEM / F12 और 10% FBS संस्कृति मीडिया का उपयोग करती है। जब संस्कृति 90 प्रतिशत confluency प्राप्त करती है, तो मीडिया को 1 सप्ताह के लिए हर दिन काटा जाता है। काटा गया मीडिया तब 2x सीएमजीएफ + (इन विकास कारकों के बिना) के साथ मिश्रित होता है। जबकि 2 डी संस्कृतियां लागत के एक अंश पर आवश्यक विकास कारकों का उत्पादन कर सकती हैं, मीडिया का उत्पादन करने के लिए अतिरिक्त समय और तैयारी की उम्मीद की जानी चाहिए। वातानुकूलित मीडिया बैचों के बीच विकास कारकों की सांद्रता भी 37,38 हो सकती है।
कैनाइन वयस्क स्टेम-सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियां एक अद्वितीय बायोमेडिकल मॉडल हैं जो वन हेल्थ इनिशिएटिव 39 के लक्ष्यों को प्राप्त करने में मदद कर सकती हैं। ऑर्गेनोइड तकनीक का उपयोग कई बुनियादी और बायोमेडिकल अनुसंधान क्षेत्रों में किया जा सकता है, जो विकासात्मक जीव विज्ञान, पैथोफिजियोलॉजी, दवा की खोज और परीक्षण, संक्रामक रोगों और पुनर्योजी चिकित्सा के अध्ययन के लिए विष विज्ञान से फैला हुआ है। ट्रांसलेशनल और रिवर्स ट्रांसलेशनल रिसर्च दोनों ऐसे क्षेत्र हैं जहां कैनाइन ऑर्गेनोइड्स लागू होते हैं15। कुत्तों का उपयोग सदियों से ट्रांसलेशनल प्रयोगात्मक सेटिंग्स में किया गया है, और उनके साथी पशु स्थिति ने पशु चिकित्सा में सबसे अधिक खोजी गई प्रजातियों में से एक के रूप में अपनी स्थिति को भी सुविधाजनक बनाया है।
अंत में, यह पांडुलिपि विभिन्न जैव चिकित्सा क्षेत्रों में इस मॉडल के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए कैनाइन हेपेटिक और आंतों के ऑर्गेनोइड्स के अलगाव, रखरखाव, कटाई और बायोबैंकिंग के लिए मानकीकृत ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रदान करती है। यह मॉडल ज्ञान के अंतर और अंतःविषय साझाकरण को बढ़ावा देने के लिए एक स्वास्थ्य पहल के एक उपकरण के रूप में रिवर्स ट्रांसलेशनल अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए विशिष्ट रूप से उपयुक्त है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के कर्मचारियों की पशु चिकित्सा नैदानिक प्रयोगशाला के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं, अर्थात्, हेली एम लैम्बर्ट, एमिली रहे, रोजालिन एम. ब्रानमैन, विक्टोरिया जे. ग्रीन, और जेनिफर एम. ग्रोएल्ट्ज़-थ्रश, प्रदान किए गए नमूनों के समय पर प्रसंस्करण के लिए। लेखकफैकल्टी स्टार्टअप, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award, और NSF SBIR उप-पुरस्कार से ISU # 1912948 को समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
기타 | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |