Högupplösta kryo-EM-kartor över makromolekyler kan också uppnås genom att använda 200 kV TEM-mikroskop. Detta protokoll visar de bästa metoderna för att ställa in exakta optiska inriktningar, datainsamlingsscheman och urval av bildområden som alla är väsentliga för framgångsrik insamling av högupplösta dataset med hjälp av en 200 kV TEM.
Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har etablerats som en rutinmässig metod för bestämning av proteinstruktur under det senaste decenniet och tar en ständigt ökande andel av publicerade strukturdata. De senaste framstegen inom TEM-teknik och automatisering har ökat både hastigheten på datainsamlingen och kvaliteten på förvärvade bilder samtidigt som den minskar den nödvändiga kompetensnivån för att erhålla kryo-EM-kartor vid sub-3 Å-upplösningar. Medan de flesta av sådana högupplösta strukturer har erhållits med hjälp av toppmoderna 300 kV kryo-TEM-system, kan högupplösta strukturer också erhållas med 200 kV kryo-TEM-system, särskilt när de är utrustade med ett energifilter. Dessutom minskar automatiseringen av mikroskopjusteringar och datainsamling med bedömning av bildkvalitet i realtid systemets komplexitet och säkerställer optimala mikroskopinställningar, vilket resulterar i ökat utbyte av högkvalitativa bilder och övergripande genomströmning av datainsamling. Detta protokoll visar implementeringen av de senaste tekniska framstegen och automatiseringsfunktionerna på ett 200 kV kryoöverföringselektronmikroskop och visar hur man samlar in data för rekonstruktion av 3D-kartor som är tillräckliga för de novo atommodellbyggnad. Vi fokuserar på bästa praxis, kritiska variabler och vanliga problem som måste beaktas för att möjliggöra rutinmässig insamling av sådana högupplösta kryo-EM-dataset. Särskilt följande viktiga ämnen granskas i detalj: i) automatisering av mikroskopinriktningar, ii) val av lämpliga områden för datainsamling, iii) optimala optiska parametrar för datainsamling av hög kvalitet, hög genomströmning, iv) energifilterjustering för nollförlustavbildning och v) datahantering och kvalitetsbedömning. Tillämpning av bästa praxis och förbättring av uppnåelig upplösning med hjälp av ett energifilter kommer att demonstreras på exemplet apo-ferritin som rekonstruerades till 1,6 Å och Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstruerad till 2,1-Å upplösning med hjälp av en 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor.
Bestämning av proteinstruktur är avgörande för att förstå molekylär arkitektur, funktion och reglering av proteinkomplex som är involverade i viktiga cellulära processer, såsom cellmetabolism, signaltransduktion eller värdpatogeninteraktioner. Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) har framstått som en kraftfull teknik som kan lösa 3D-strukturen hos många proteiner och deras komplex som var för utmanande för de traditionella strukturteknikerna, såsom röntgendiffraktion och NMR-spektroskopi. Särskilt har kryo-EM visat sig vara den metod som valts för membranproteiner, som inte lätt kan kristalliseras eller framställas i tillräckliga mängder för de traditionella strukturteknikerna, och gett nya insikter i strukturen och funktionen hos viktiga cellulära receptorer och jonkanaler 1,2,3,4,5 . Senast har kryo-EM spelat en viktig roll i kampen mot Covid-19-pandemin genom att bestämma mekanismen för SARS-CoV-2-infektion på molekylär nivå, vilket belyste ursprunget till Covid-19-sjukdomen och utgjorde grunden för den snabba utvecklingen av effektiva vacciner och terapier 6,7,8,9,10.
Vanligtvis används avancerade 300 kV transmissionselektronmikroskop (TEM) för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler genom kryo-EM-enpartikelanalys (SPA) för att avslöja deras konformation och interaktioner. Nyligen nådde SPA-tekniken en ny gräns när det gemensamma riktmärket kryo-EM-prov apo-ferritin rekonstruerades vid atomupplösning (1,2 Å)11,12 med hjälp av en 300 kV TEM utrustad med kallfältsemissionspistolen (E-CFEG), en direktelektrondetektor och ett energifilter. Vid denna upplösning var det möjligt att entydigt lösa positioner för enskilda atomer i strukturen, konformation av enskilda aminosyrasidokedjor samt vätebindning och andra interaktioner, vilket öppnar nya möjligheter för strukturbaserad läkemedelsupptäckt av nya mål och optimering av befintliga läkemedelskandidater.
Mellanklass 200 kV TEM-mikroskop används ofta för provscreening och provoptimering före slutlig högupplöst datainsamling med hjälp av avancerade TEM-mikroskop, särskilt vid större kryo-EM-anläggningar. Vanligtvis kan avbildade prover lösas i upplösningsområdet 3-4 Å som är tillräckligt för att flytta till en avancerad 300 kV TEM för slutlig datainsamling. Följaktligen är datainsamling med hjälp av 200 kV TEM ofta inte ytterligare optimerad för högsta möjliga upplösningsresultat. Dessutom kan många intressanta biologiska frågor redan besvaras och publiceras vid dessa resolutioner eftersom alla aminosyras sidokedjor redan är lösta, och beläggningen av ligandbindningsställen kan också bestämmas på ett tillförlitligt sätt13. Det har redan visats att 200 kV TEM kan nå upplösningar utöver 3 Å för många prover 14,15,16,17,18. Bilder tagna med 200 kV uppvisar i sig högre kontrast av avbildade partiklar, vilket till och med kan underlätta mer exakt initial inriktning av partiklarna trots mer dämpad signal vid hög upplösning jämfört med 300 kV TEM-bilder. Det är viktigt att notera att den uppnådda upplösningen av rekonstruerade kryo-EM-kartor också begränsas av strukturell flexibilitet och konformationsheterogenitet hos avbildade prover, vilket påverkar både 200 kV och 300 kV rekonstruktioner. Faktum är att mycket fler kryo-EM-rekonstruktioner som erhölls med 300 kV-systemen löstes i upplösningsområdet 3-4 Å än vid högreupplösningar 19. Eftersom 200 kV TEM-mikroskop är mindre komplexa och passar in i mindre rum, representerar dessa mikroskop ett bra, billigare alternativ för strukturbestämning av biologiska makromolekyler med kryo-EM samtidigt som automatisering av långa datainsamlingar från flera prover lagrade i mikroskop autoloader-systemet bevaras.
Insamling av kryo-EM-dataset för högupplöst strukturbestämning kräver noggrann anpassning av mikroskopoptiken. Kolonninriktningar fortsätter systematiskt från elektronkällan ner till kondensorlinssystemet, objektivlinsen och energifiltret med en elektrondetektor. Den fullständiga sekvensen av justeringar krävs vanligtvis inte. Vid behov guidas användaren via halvautomatiska procedurer med en korrekt beskrivning av varje steg i ett kontextmedvetet hjälpfönster under hela justeringsproceduren i mikroskopets användargränssnitt (kontrollpanelen för direkta justeringar). När mikroskopet är helt inriktat förblir elektronoptiken stabil och inriktningarna behöver inte ändras på minst några månader. Endast de känsligaste justeringarna, till exempel parallell belysning av provplanet, objektiv astigmatism och komafri justering, måste förfinas precis innan insamlingen av varje datauppsättning påbörjas. Kvaliteten på insamlade data kan sedan övervakas under datainsamling med hjälp av olika mjukvarupaket, såsom EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.
Förutom noggranna anpassningar av mikroskopet är den höga kvaliteten på välrenade prover med minimal konformations- och kompositionell heterogenitet också en förutsättning för insamling av högupplösta dataset och lösning av högupplösta strukturer. Mer information om typiska protokoll, frekventa utmaningar och möjliga lösningar finns i andra recensioner tillägnad detta ämne 25,26,27. I huvudsak är det viktigt att hitta områden på ett visst kryo-EM-nät som har tillräckligt tunn is för att bevara högupplöst information, och enskilda partiklar fördelas tätt vid slumpmässiga orienteringar utan överlappningar. Typiska kryo-EM-nät har emellertid ojämn istjocklek, och det är därför viktigt att hitta och välja de optimala områdena för avbildning. Olika sätt att uppskatta istjockleken på nätet finns i programvarupaket avsedda för automatiserad insamling av kryo-EM-dataset, såsom EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.
Tillkomsten av snabba och känsliga direkta elektrondetektorer möjliggjorde insamling av bilder i många fraktioner som filmer som möjliggjorde kompensation av strålinducerade rörelser och resulterade i en betydande ökning av kvaliteten och kvantiteten av data som används vid bildbehandling och slutlig 3D-rekonstruktion30. Samtidigt ger automatisering och datainsamling med högt dataflöde enorma datamängder med tusentals bilder/filmer som utgör utmaningar för datalagring och åtkomst. Den antagna modellen med stora kryo-EM-anläggningar som betjänar tiotals till hundratals användare kräver särskilt organiserad datahantering med korrekt spårning och datadelning i etablerade kryo-EM-rörledningar31,32.
Denna studie beskriver ett protokoll för rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med hjälp av 200 kV Glacios TEM-mikroskop. Nödvändiga anpassningar av mikroskopoptiken beskrivs tillsammans med förfaranden för utvärdering av kryo-EM-prover och val av lämpliga områden för högupplöst datainsamling. Organisationen av insamlade data och relaterade metadata med provinformation demonstreras i Athena – en datahanteringsplattform som underlättar granskningen av provinformation och insamlade data. Med hjälp av musens apo-ferritinprov var det möjligt att uppnå en 3D-rekonstruktion vid 1,6 Å upplösning13. Med hjälp av det beskrivna protokollet rekonstruerade vi också 3D-densitetskartan över 20S-proteasomen från Thermoplasma acidophilum vid 2,1 Å-upplösning.
Det beskrivna protokollet förutsätter att optiken hos det använda TEM-mikroskopet är i ett väljusterat tillstånd. För TEM på 200 kV som används i detta protokoll görs, verifieras och sparas sådana kolumnjusteringar av en erfaren servicetekniker efter mikroskopinstallation eller någon betydande serviceintervention. Dessa justeringsinställningar kan återkallas när som helst i mikroskopets användargränssnitt. Användare kan använda direct alignment-procedurerna i mikroskopgränssnittet för att justera kritiska parametrar igen. Vissa inriktningar, såsom pistollutning och pistolförskjutning, är stabila och behöver inte justeras av användare dagligen. Kontroller och omjusteringar (om så krävs) av pistollutning och förskjutning av mikroskopövervakaren rekommenderas två gånger om året. Å andra sidan är vissa anpassningar kritiska och måste anpassas före varje datainsamling som beskrivs i protokollet ovan (såsom objektiv astigmatism och komafri anpassning). Om Autokoma-funktionen i analysprogramvaran inte konvergerar, bör justering av strålens lutningssvängpunkter och/eller rotationscentrum verifieras och justeras, och korrekt centrering av C2-bländaren bör bekräftas. Därefter bör Autostigmate-funktionen köras eftersom objektiva stigmatorer också används för komakorrigering. Dessa justeringar bör itereras tills både Autostigmate och Autocomafunctions lyckas med sin första iteration. Vid behov kan ett annat område väljas (t.ex. stödja kolfolie utan is), avbildad defokus justeras eller bildförvärvstiden ökas för att optimera signal-brusförhållandet i förvärvade bilder och synligheten för flera Thon-ringar i Fourier-transformen av de förvärvade bilderna.
Moderna kryo-EM-mikroskop genererar stora mängder data som ofta överstiger 1 TB per dataset för att uppnå högupplösta 3D-rekonstruktioner, särskilt för proteiner med låg symmetri. Cryo-EM-data och resultat kompletteras också vanligtvis med data och resultat från ortogonala metoder för att fullt ut förstå struktur-funktionsrelationer i varje vetenskapligt projekt. Organisering av insamlade data, deras överföring till en bildbehandlingspipeline och delning av en resulterande kryo-EM-rekonstruktion bland medarbetare ställer ytterligare krav på nya adoptörer av kryo-EM-metodik för att inrätta sin lokala IT-infrastruktur. Datahanteringsprogramvara, såsom Athena, underlättar centraliserad lagring av data som förvärvats av alla anslutna instrument eller program som drivs av en registrerad användare. Lagrade data och metadata är tillgängliga med ett enkelt webbläsargränssnitt för flera användare, som kan ha olika roller i projektet med olika åtkomsträttigheter (antingen som ägare, medarbetare eller tittare) baserat på deras inloggningsuppgifter och datadelningsdefinition i experimentkonfigurationen. Denna digitalisering av experimentella arbetsflöden ger möjlighet till data- och metadatadelning mellan medarbetare utan onödigt dubbelarbete och ökar produktiviteten och spårbarheten för använda arbetsflöden. Implementering av en allmän och anpassningsbar struktur av projekt, experiment och arbetsflöden i datahanteringsprogramvara är universell och möjliggör anpassning och integration av ortogonala experiment med hjälp av kompletterande metoder i en enda projektdatabas.
Valet av områden för datainsamling på ett kryo-EM-nät är avgörande för ett framgångsrikt förvärv av högupplösta dataset. Cryo-EM-galler som produceras med traditionella fallfrysningsanordningar, såsom Vitrobot (ett helautomatiserat förglasningssystem), kommer vanligtvis att visa en gradient av istjocklek över gallerytan (figur 4). Detta kan vara fördelaktigt eftersom gallret innehåller områden med olika istjocklekar; Områden med den ideala istjockleken för datainsamling måste dock identifieras enligt beskrivningen i protokollet ovan. Ett optimalt kryo-EM-nät bör innehålla så lite överföringsisförorening som möjligt och innehålla tillräckligt med rutnätsrutor med intakt hålig stödfolie. Insamling av data om rutnätsrutor som har sprickor eller trasiga områden rekommenderas inte eftersom insamlade bilder kommer att påverkas av betydligt starkare total drift vid belysning av en elektronstråle jämfört med rutnätsrutorna med intakt stödfolie. Överskott av kristallin is kan täppa till majoriteten av foliehålen och / eller störa autofokusering och sådana rutnätsrutor bör också undvikas. Rutnätsrutor med tunn is uppvisar vanligtvis stora glasytor och många ljusa foliehål som syns i en bild tagen med Atlas-förinställningen. Förekomsten av tjockare is nära gallerstänger är att förvänta sig och okritisk eftersom foliehål i dessa områden av rutnätstorget utesluts under hålvalsförfarandet. Närvaron av flera tomma hål i en rutnätskvadrat kan betyda att glasris i de omgivande hålen är extremt tunn och kan innehålla skadade partiklar eller inga partiklar alls. I allmänhet är det klokt att välja rutnätsrutor med olika istjocklekar vid olika regioner på nätet för inledande screening och bedömning för att förstå vilka områden som har de bästa förutsättningarna för högupplöst datainsamling och uppvisar den ideala partikeldensiteten och orienteringsfördelningen. För de apoF- och 20S-proteasomprover som används i denna studie innehåller områden med den tunnaste observerbara isen de bästa förutsättningarna för högupplöst avbildning av dessa prover.
När du väljer hål automatiskt i alla valda rutnätsrutor med hjälp av datainsamlingsprogramvaran rekommenderas det att utföra mallkörningsuppgift på ett representativt hål i varje rutnätsruta för att kontrollera och säkerställa att varken alltför tjocka eller alltför tunna eller oväntat icke-glasrutor valdes för datainsamling. Under datainsamlingen kan viktiga kvalitetsindikatorer för insamlade bilder, såsom bilddrift och CTF-montering, övervakas med EQM. Datainsamlingen kan sedan optimeras genom att hoppa över områden som ger bilder av dålig kvalitet. Bilder med högupplösta CTF-passningar kan dock fortfarande innehålla bilder med partiklar i några få föredragna riktningar eller partiklar denaturerade i ett för tunt islager. Partikelplockning i realtid och 2D-klassificering från insamlade bilder skulle ge ytterligare information om kvaliteten på strukturdata i avbildade partiklar och avslöja både föredragna orienteringar av intakta partiklar i is eller inkonsekvent struktur av (delvis) denaturerade partiklar. Beräkning av klassmedelvärde kan därför bidra till att ytterligare förfina lämpliga regioner för datainsamling, vilket redan har implementerats och visats i andra programvarupaket23,28.
Val av avbildningsinställningar för datainsamling, såsom förstoring, elektrondosrat och defokusområde, beror på flera kriterier, såsom målupplösning, proteinets storlek, provkoncentration, önskad mikroskopgenomströmning etc. För den direkta elektrondetektorkameran som användes i dessa experiment valdes elektrondosraten i intervallet 4-5 e-/pix/s genom att välja en lämplig SPOT-storlek och intensitet för att upprätthålla parallell belysning. Som visas i tabell 1 kan en annan SPOT-storlek användas i förinställningen Hål/Eucentrisk höjd för att säkerställa tillräckligt signal-brusförhållande i bilden för centrering av hål under datainsamling. Förstoringen bör väljas så att pixelstorleken är minst 2-3x mindre än målupplösningen för kryo-EM-rekonstruktionen. Den högre förstoringen (dvs. mindre pixelstorlek) används dock, det mindre synfältet fångas i bilder och det finns mindre partiklar per bild, vilket i slutändan leder till längre datainsamlingstid för att samla in bilder med tillräckligt med partiklar för att rekonstruera 3D-kartor till en hög upplösning. För apoF-provet använde vi pixelstorleken 0,43 Å eftersom vi hade tillräcklig provkoncentration för hög densitet av partiklar i bilder och riktade sub-2 Å upplösning av rekonstruktionen. För 20S-proteasomprovet använde vi pixelstorleken 0,68 Å för att täcka ett större synfält i förvärvade bilder. Typiskt för 200 kV TEM-mikroskop förvärvas kryo-EM-bilder i defokusområdet från 0,8 till 2,0 μm. Men med det förbättrade kontrast- och signalbrusförhållandet med hjälp av energifiltret kan datainsamlingar göras mycket närmare fokus för att bättre bevara högupplöst information i förvärvade bilder på grund av mindre avvikelser och motsvarande minskat sönderfall av CTF-kuvertfunktionen. Vi använder inte heller en objektiv bländare eftersom bländaren kan införa ytterligare bildavvikelser medan bildkontrasten redan är tillräckligt förbättrad genom att använda energifiltret. För apoF- och 20S-proteasomproverna använde vi defokusinställningarna på 0,5 μm, 0,7 μm och 0,9 μm. För mindre proteiner (<200 kDa) använde vi defokusinställningar på -0,5 μm, -0,7 μm och -0,9 μm för att förbättra partiklarnas kontrast och underlätta enklare partikelplockning och initial grov inriktning i 3D-förfiningssteget för 3D-rekonstruktion, vilket ledde till ~ 2,5 Å upplösning 3D-kartor (opublicerade resultat).
Vi har redan visat att avbildning med ett energifilter förbättrar signal-brusförhållandet (SNR) i kryo-EM-bilder som samlats in på de avancerade 300 kV TEM-mikroskopen11. Faktum är att när elektroner passerar genom ett prov uppstår två huvudtyper av interaktioner: i) Elastiskt spridda elektroner bibehåller sin energi och bidrar till bildbildning genom störningar i den icke-spridda infallande strålen via faskontrastmekanismen ii) oelastiskt spridda elektroner förlorar lite energi i provet och bidrar huvudsakligen till brus i bilder. Därför kan SNR förbättras avsevärt genom att filtrera de oelastiskt spridda elektronerna, som har lägre energi än den infallande strålen och elastiskt utspridda elektroner, med hjälp av en smal energislits. Det är dock viktigt att använda ett tillräckligt stabilt energifilter, såsom Selectris eller Selectris-X, för att kunna använda mycket smala (10 eV eller mindre) slitsar under lång (12+ timmar) automatiserad datainsamling av högupplösta kryoEM-dataset.
Cryo-EM-bilder som förvärvats med 200 kV TEM-mikroskop vid samma förhållanden som med 300 kV TEM-mikroskop uppvisar mindre SNR vid hög upplösning (särskilt <4 Å) på grund av snabbare sönderfall av CTF-kuvertfunktionerna. Följaktligen krävs ett högre antal partiklar (och därmed ett högre antal insamlade bilder) för att uppnå en viss upplösning vid användning av 200 kV TEM. Dessutom är skärpedjupet (10-25 nm i upplösningsområdet 2-3 Å) också cirka 20% mindre i 200 kV-bilder35, vilket innebär att mindre partiklar i isskiktet (vanligtvis 20-50 nm tjockt) kommer att vara helt i fokus och konstruktivt bidra till alla högupplösta funktioner i en beräknad 3D-rekonstruktion om inte defokusvärdena förfinas för varje partikel oberoende av varandra i de senare stadierna av 3D-rekonstruktionsproceduren. För större partiklar (såsom ikosaedriska virioner eller andra makromolekylära sammansättningar) kan partikelstorleken överstiga skärpedjupet vid höga upplösningar och införa fasfel på grund av plan approximation av Ewaldsfären i standard 3D-rekonstruktionsalgoritmerna36. Dessa fel kan förfinas av avancerade algoritmer som redan är implementerade i vanliga kryo-EM-bildbehandlingspaket 37,28,39. Eftersom Ewaldsfären har större krökning i 200 kV-data än 300 kV-data behövs Ewald-sfärkorrigeringen vid relativt lägre upplösningar och/eller för relativt mindre makromolekylära enheter vid användning av 200 kV TEM. Å andra sidan uppvisar 200 kV-bilder högre kontrast av partiklar i tunn is (20-50 nm) som är betydligt tunnare än 200-300 keV-elektronens genomsnittliga fria väg (220-280 nm). Den högre kontrasten bidrar till att förbättra den korrekta globala inriktningen av enskilda partiklar, särskilt för svagt spridda mindre proteiner vars struktur ännu inte är känd, och 3D-referensmodellen är ännu inte väl etablerad.
Här visade vi på exemplet med en 20S proteasom att bildkontrast och kvalitet på samma sätt kan förbättras med ett energifilter när man använder ett 200 kV TEM-mikroskop. Med samma antal partiklar rekonstruerades data som samlats in med hjälp av 20 eV-slitsen till 2,26 Å-upplösning jämfört med data som samlats in med den helt öppnade energislitsen som endast rekonstruerades till 2,34 Å-upplösning. Den bästa rekonstruktionen uppnåddes från data som samlats in med hjälp av 10 eV-slitsen som rekonstruerades till 2,14 Å upplösning. Dessa resultat är i överensstämmelse med den teoretiska förutsägelsen att filtrering av de olastiskt spridda elektronerna ökar SNR i insamlade bilder och underlättar högre upplösning i kryo-EM-rekonstruktioner från det givna antalet partiklar, som sammanfattas i tabell 4. Dessa resultat bekräftades ytterligare av B-faktorer beräknade från dessa dataset som indikerar högre kvalitet på bilderna i de energifiltrerade dataseten.
Vi kan därför dra slutsatsen att medan 300 kV TEM-mikroskop levererar högsta genomströmning och högsta möjliga upplösning i kryo-EM-rekonstruktioner, ger 200 kV TEM-mikroskop också högkvalitativa dataset för högupplösta kryo-EM-rekonstruktioner. Vi visade här att kvaliteten på förvärvade bilder, och därmed den totala tiden till struktur, kan förbättras ytterligare genom att använda 200 kV TEM utrustad med ett energifilter och en direktelektrondetektor. Det presenterade protokollet beskriver alla nödvändiga steg för hur man rutinmässigt kan erhålla högupplösta kryo-EM-data med hjälp av denna inställning och avslöja fina strukturella detaljer om makromolekylära 3D-strukturer, som är väsentliga för att förstå de viktigaste struktur-funktionsförhållandena i strukturbiologi och strukturbaserad läkemedelsdesign.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |