Forsterkning av Escherichia coli i en kontinuerlig flow-PCR mikrofluidisk chip og dens deteksjon med et kapillært elektroforesesystem

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man bygger et kontinuerlig strømningspolymerasekjedesystem basert på en mikrofluidisk chip og hvordan man bygger et kapillærelektroforesesystem i laboratoriet. Den presenterer en enkel metode for analyse av nukleinsyrer i laboratoriet.

Abstract

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en tradisjonell metode som brukes til amplifisering av et målgen som har spilt en viktig rolle i biomolekylær diagnostikk. Tradisjonell PCR er imidlertid svært tidkrevende på grunn av variasjonseffektiviteten ved lave temperaturer. Dette arbeidet foreslår et kontinuerlig flow-PCR (CF-PCR) system basert på en mikrofluidisk chip. Forsterkningstiden kan reduseres kraftig ved å kjøre PCR-løsningen inn i en mikrokanal plassert på varmeovner som er satt til forskjellige temperaturer. Dessuten, da kapillær elektroforese (CE) er en ideell måte å skille mellom positive og falske positive PCR-produkter, ble et CE-system bygget for å oppnå effektiv separasjon av DNA-fragmentene. Dette papiret beskriver prosessen med forsterkning av Escherichia coli (E. coli) av CF-PCR-systemet innebygd internt og påvisning av PCR-produktene ved CE. Resultatene viser at målgenet av E. coli ble vellykket amplifisert innen 10 minutter, noe som indikerer at disse to systemene kan brukes til rask amplifisering og påvisning av nukleinsyrer.

Introduction

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en molekylærbiologisk teknikk som brukes til å amplifisere spesifikke DNA-fragmenter, og derved forsterke spormengder av DNA hundrevis av millioner ganger. Det har blitt mye brukt i klinisk diagnose, medisinsk forskning, mattrygghet, rettsmedisinsk identifikasjon og andre felt. PCR-prosessen består hovedsakelig av tre trinn: denaturering ved 90-95 °C, glødning ved 50-60 °C og forlengelse ved 72-77 °C. Termisk sykling er en viktig del av PCR-prosessen; Den tradisjonelle PCR-termiske syklisten er imidlertid ikke bare klumpete, men også ineffektiv, og krever omtrent 40 minutter for å fullføre 25 sykluser. For å overvinne disse begrensningene ble et kontinuerlig PCR-system (CF-PCR) bygget internt, basert på en mikrofluidisk brikke. CF-PCR kan i stor grad spare tid ved å kjøre PCR-løsningen inn i mikrokanaler plassert på varmeovner ved forskjellige temperaturer 1,2,3,4,5.

Siden kapillær elektroforese (CE) har mange fordeler, for eksempel høy oppløsning, høy hastighet og utmerket reproduserbarhet 6,7,8,9,10,11^, har det blitt et populært verktøy i laboratoriet for analyse av nukleinsyrer og proteiner. Imidlertid har de fleste laboratorier, spesielt laboratorier i utviklingsland, ikke råd til denne teknologien på grunn av den høye prisen på CE-instrumentet. Her har vi skissert protokoller for hvordan man fremstiller CF-PCR mikrofluidisk chip og hvordan man bygger et allsidig CE-system i laboratoriet. Vi demonstrerer også prosessen med forsterkning av E. coli ved dette CF-PCR-systemet og påvisning av PCR-produktene av CE-systemet. Ved å følge prosedyrene beskrevet i denne protokollen, bør brukerne kunne fremstille mikrofluidiske chips, forberede PCR-løsninger, bygge et CF-PCR-system for nukleinsyreamplifikasjon og sette opp et enkelt CE-system, selv med begrensede ressurser, for å skille DNA-fragmenter.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen. 1. Fabrikasjon av CF-PCR mikrofluidbrikke Varm silisiumskiven ved 200 °C i 25 minutter for å fjerne fuktigheten. Dispenser 1 ml SU-8-2075 fotoresist per tomme av waferen. Spinn den på silisiumskiven ved hjelp av en spinnbelegger ved 500 o / min i 5-10 s med en akselerasjon på 100 o / s, og deretter ved 2000 o / mi…

Representative Results

Figur 5 representerer elektroferogrammet til PCR-produktene og DNA-markørene. Spor (figur 5A) er CE-resultatet av CF-PCR-amplifisert produkt, spor (figur 5B) er CE-resultatet av produktet forsterket av termisk syklus, og spor (figur 5C) er CE-resultatet av 100 bp DNA-stigen. Vi forsterket først målgenet til E. coli i CF-PCR-systemet; PCR-løsningen tok ~ 10 min, 30 s fra innløpet til utløp…

Discussion

Både PCR og CE er to populære bioteknologier i analysen av nukleinsyrer. Dette papiret beskriver forsterkningen av E. coli og påvisning av PCR-produktene ved hjelp av CF-PCR- og CE-systemene, begge innebygd internt. Målgenet til E. coli ble vellykket forsterket innen 10 minutter på grunn av de høye varmeoverføringshastighetene. DNA-fragmentene mindre enn 1 500 bp ble separert innen 8 minutter (figur 5). Den store fordelen med disse to teknikkene er at det i stor grad…

Materials

100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
10x Fast Buffer I	Takara Bio Inc.	RR070A
10x TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
developer solution	Alfa Aesar, USA	L15459
dNTP mixture (2.5 μM)	Takara Bio Inc.	RR070A
EC-F	Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R	Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K	Sigma-Aldrich, USA	9004-62-0
isopropanol	Aladdin, Shanghai, China	67-63-0
microscope	Olympus, Japan	BX51
photolithography	SUSS MicroTec, Germany	MJB4
photomultiplier tube	Hamamatsu Photonics, Japan	R928
photoresist	MicroChem, USA	SU-8 2075
PID temperature controllers	Shanghai, China	XH-W2023
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP)	Aladdin, Shanghai, China	P110608
pump	Harvard Apparatus	PHD2000
silicone tubing	BIO-RAD,USA	7318210
solid-state relays	KZLTD, China	KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase	Takara Bio Inc.	RR070A
steel needle	zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN	Solarbio, Beijing, China	SY1020
temperature sensors	EasyShining Technology, Chengdu, China	TCM-M207
Template (E. coli)	Takara Bio Inc.	AK601
Tween 20	Aladdin, Shanghai, China	T104863
voltage power supply	Medina, NY, USA	TREK MODEL 610E