Inaktivering av patogener via fotolyse i synlig lys av riboflavin-5′-fosfat

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å inaktivere patogene bakterier med reaktive oksygenarter produsert under fotolyse av flavin mononukleotid (FMN) under bestråling av blått og fiolett lys med lav intensitet. FMN-fotolyse er vist å være en enkel og sikker metode for sanitære prosesser.

Abstract

Riboflavin-5′-fosfat (eller flavin mononukleotid; FMN) er følsom for synlig lys. Ulike forbindelser, inkludert reaktive oksygenarter (ROS), kan genereres fra FMN-fotolyse ved bestråling med synlig lys. ROS generert fra FMN-fotolyse er skadelig for mikroorganismer, inkludert patogene bakterier som Staphylococcus aureus (S. aureus). Denne artikkelen presenterer en protokoll for deaktivering av S. aureus, som et eksempel, via fotokjemiske reaksjoner som involverer FMN under bestråling av synlig lys. Superoksidradikalanionen () generert under FMN-fotolysen evalueres via reduksjon av nitroblått tetrazolium (NBT). Den mikrobielle levedyktigheten til S. aureus som tilskrives reaktive arter, ble brukt til å bestemme effektiviteten av prosessen. Den bakterielle inaktiveringshastigheten er proporsjonal med FMN-konsentrasjonen. Fiolett lys er mer effektivt ved å inaktivere S. aureus enn bestråling av blått lys, mens det røde eller grønne lyset ikke driver FMN-fotolyse. Denne artikkelen demonstrerer FMN-fotolyse som en enkel og sikker metode for sanitære prosesser.

Introduction

Riboflavin-5′-fosfat (FMN) dannes ved fosforylering ved riboflavin 5′-posisjonen til ribityl-sidekjeden og kreves av alle flavoproteiner for mange cellulære prosesser for å generere energi. Det spiller også rollen som vitamin for noen funksjoner^{i menneskekroppen.} FMN er omtrent 200 ganger mer løselig i vann enn riboflavin².

Den antibakterielle fotodynamiske inaktiveringen (aPDI) av bakterier er en effektiv måte å kontrollere resistens mot bakterier ^3,4 fordi den ikke er avhengig av modusen for bakteriell resistens. Klinisk brukes aPDI til å behandle bløtvevsinfeksjoner for å redusere infeksjon av nosokomial hud på grunn av multiresistente bakterier 5,6,7,8,9. aPDI produserer også celledød ved å generere reaktive oksygenarter (ROS). ROS, som superoksidradikaler (), singlet oksygen, hydroksylradikaler (^•OH) og peroksylradikaler, er frie radikaler eller molekyler som inneholder reaktivt oksygen 10,11,12 og er normalt reaktive ¹³. I likhet med DNA-skade som er forårsaket av ROS, er membranperoksydasjon og ødeleggelse av endotelceller også uønskede biokjemiske reaksjoner som tilskrives ROS i celler¹².

Bruken av aPDI for patogene bakterier innebærer en synlig eller UV-lyskilde for å inaktivere mikroorganismer i nærvær av kjemiske forbindelser, slik som metyltioniniumklorid 14, PEI-c_e6 konjugat 15, porfyrin 16, titandioksid 17, toluidinblått^O18 og sinkoksid nanopartikler ¹⁹. Toluidinblå O og metylenblå er fenotiaziniumfarger og metylenblå har giftige egenskaper. Sinkoksid nanopartikler og UV-bestråling er knyttet til negative helse- og miljøeffekter. Som sådan fortjener utnyttelsen av en pålitelig, sikker og enkel fotosensibilisator via fotolyse under synlig bestråling videre studier.

Mikronæringsstoffet, riboflavin eller FMN, er ikke giftig og brukes faktisk til matproduksjon eller fôring²⁰. Både FMN og riboflavin er svært følsomme for lysbestråling². Under UV 1,2,21,22,23 og blålysbestråling ^10,24 oppnår disse to forbindelsene en eksitert tilstand. Den aktiverte riboflavin eller FMN som produseres ved fotolyse fremmes til sin tripletttilstand og ROS genereres samtidig ^2,25. Kumar og medarbeidere rapporterte at riboflavin aktivert av UV-lys selektivt forårsaker økt skade på guanindelen av DNA i patogene mikroorganismer²⁶. Under bestråling av UV-lys er fotodynamisk aktivert riboflavin demonstrert for å fremme genereringen av 8-OH-dG, som er en biomarkør for oksidativt stress, i dobbeltstrenget DNA²⁷. Det er rapportert at S. aureus og E. coli deaktiveres av ROS under riboflavin eller FMN fotolyse 10,24,28. En tidligere studie av forfatterne viste at de fotolytiske reaksjonene som involverer riboflavin og FMN reduserer krystallfiolett, et triarylmetanfargestoff og et antibakterielt middel som genererer , og eliminerer det meste av den antimikrobielle evnen til krystallfiolett²⁸. Når flavin adenin dinukleotid eller FMN bestråles av blått lys, produserer den resulterende ROS apoptose i HeLa-celler for forgiftning in vitro²⁹. Ved bruk av fotokjemisk behandling i nærvær av riboflavin inaktiverte Cui og medarbeidere lymfocytter ved å hemme deres proliferasjon og cytokinproduksjon³⁰.

Fotolysen av riboflavin brukes til inaktivering av blodpatogen ved UV 10,24^, men blodkomponenter kan svekkes under UV-lysbestråling³⁰. Det er også rapportert at blodplater utsatt for UV gradvis forbedrer ytelsen til aktiveringsmarkørene P-selectin og LIMP-CD63 på membranene. Cytotoksisiteten til UV og høyintensitetsbestråling må undersøkes, og en fotosensibilisator som er ukomplisert og sikker under en FMN-fotoreaksjon som involverer synlig lys, vil være til stor nytte.

Lys med kortere bølgelengder har mer energi og er mye mer sannsynlig å forårsake alvorlig skade på celler. Men i nærvær av en egnet fotosensibilisator kan bestråling med fiolett lys med lav intensitet hemme patogene mikroorganismer. Fotosensibiliseringen og genereringen av av FMN når den bestråles med fiolett lys er derfor viktig å studere, for å bestemme banen som ROS fra FMN-fotolyse øker inaktiveringen av bakterier.

Antimikrobiell kontroll er et vanlig problem, og utviklingen av nye antibiotika tar ofte flere tiår. Etter bestråling med fiolett lys kan fotoinaktivering som formidles av FMN tilintetgjøre miljøpatogene bakterier. Denne studien presenterer en effektiv antimikrobiell protokoll in vitro ved bruk av fiolett lys for å drive FMN-fotolyse og dermed generere for aPDI. Den mikrobielle levedyktigheten til S. aureus brukes til å bestemme muligheten for FMN-indusert aPDI.

Protocol

1. Oppsett av fotolysesystem Monter seks lysdioder (LED) (DC 12 V) på innsiden av en ugjennomsiktig plastkopp (8 cm x 7 cm) som vist i figur 1 for å etablere et fotolysesystem31. Tilsett reaktanter (se nedenfor) i glassreagensrørene (13 mm i diameter og 100 mm i høyden) og fest rørene på toppen av koppen som vist i figur 1. Plasser det eksperimentelle oppsettet i et rom med en jevn temperatur på…

Representative Results

Effekt av lysbølgelengde på FMNAbsorbansspektrene på 0,1 mM FMN som bestråles ved hjelp av blå, grønne, røde og fiolette lysdioder er vist i figur 3. Det er to topper for FMN (372 nm og 444 nm) for den mørke kontrollen. Grønt og rødt lys har ingen effekt fordi endringer i spektrene er ubetydelige. På den annen side reduseres den respektive absorbansen av FMN ved 444 nm med henholdsvis ca. 19% og 34% etter bestråling av blått og fiolett lys ved 10 W / m2…

Discussion

En fotosensibilisator øker den fotokjemiske reaksjonen av kjemiske forbindelser for å generere ROS. Patogene mikroorganismer kan inaktiveres ved lysbestråling i nærvær av fotosensibilisatorer. Denne studien bestemmer aPDI av S. aureus på grunn av ROS generert av fiolett lysbestråling av en eksogen fotosensibilisator, FMN.

Som vist i figur 3, for FMN, reduseres absorbansen ved 444 nm signifikant etter 5 minutters bestråling ved bruk av fiolett elle…

Materials

Blue, green and red LED lights	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan		DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Infrared thermometer	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
LB broth	Difco Co., NJ
L-Methionine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply	China tech Co., New Taipei City, Taiwan	YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
RNase	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
UV-Vis optical spectrometer	Ocean Optics, Dunedin, FL	USB4000
UV-Vis spectrophotometer	Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan	U-2900
Violet LED	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China