Atomkraftmikroskopiindrykningsprotokollen giver mulighed for at dissekere rollen som de fysiske egenskaber ved cellevæggen i en bestemt celle i et væv eller organ under normal eller begrænset vækst (dvs. under vandunderskud).
En metode er beskrevet her for at karakterisere de fysiske egenskaber af cellevæggen af epidermale celler af levende Arabidopsis rødder gennem nanoindrykninger med et atomkraftmikroskop (AFM) kombineret med et optisk omvendt fluorescensmikroskop. Metoden består i at anvende kontrollerede kræfter på prøven, mens den måler dens deformation, hvilket muliggør kvantificering af parametre som det tilsyneladende Youngs modul af cellevægge ved subcellulære opløsninger. Det kræver en omhyggelig mekanisk immobilisering af prøven og korrekt valg af indgange og indrykningsdybder. Selvom det kun kan bruges i eksternt væv, tillader denne metode karakterisering af mekaniske ændringer i plantecellevægge under udvikling og muliggør korrelation af disse mikroskopiske ændringer med væksten af et helt organ.
Planteceller er omgivet af en cellevæg, der er en kompleks struktur sammensat af interagerende netværk af polysaccharider, proteiner, metabolitter og vand, der varierer i tykkelse fra 0,1 til flere μm afhængigt af celletypen og vækstfasen 1,2. Cellevæg mekaniske egenskaber spiller en væsentlig rolle i væksten af planter. Cellevæggens lave stivhedsværdier er blevet foreslået som en forudsætning for cellevækst og cellevægsudvidelse, og der er stigende tegn på, at alle celler fornemmer mekaniske kræfter til at udføre deres funktioner. Det diskuteres dog stadig, om ændringer i cellevæggens fysiske egenskaber bestemmer celleskæbne 2,3,4. Fordi planteceller ikke bevæger sig under udviklingen, afhænger den endelige form af et organ af, hvor langt og i hvilken retning en celle udvider sig. Arabidopsis rod er således en god model til at studere virkningen af cellevægs fysiske egenskaber i celleudvidelse, fordi forskellige typer ekspansion forekommer i forskellige områder af roden. For eksempel er anisotrop ekspansion tydelig i forlængelseszonen og især mærkbart i de epidermale celler5.
Metoden beskrevet her blev brugt til at karakterisere de fysiske egenskaber af cellevæggen i epidermale celler på nanoskala af levende Arabidopsis rødder ved hjælp af et Atomic Force Microscope (AFM) kombineret med et omvendt fluorescensfasemikroskop 6. For en omfattende revision af AFM-teknikken, læs 7,8,9.
Denne protokol skitserer en grundlæggende prøveforberedelsesmetode og en generel metode til AFM-baserede elasticitetsmålinger af plantecellevægge.
Figur 1: Skematisk oversigt over kraftindrykningseksperiment i Arabidopsis rødder ved hjælp af atomkraftmikroskopi (AFM). Skemaet giver et overblik over trinene i et kraftindrykningseksperiment fra forberedelsen af substratet til at immobilisere rodprøven fast (1-2), bekræftelse af rodlevedygtighed gennem propidiumiodidfarvning (3), cantileverpositionering på overfladen af en langstrakt epidermal celle af den primære rod (4-5), kraftkurvemåling (6) og kraftkurvebehandling for at beregne det tilsyneladende Youngs modul (7-8). EZ: forlængelseszone. Klik her for at se en større version af denne figur.
Celle- og cellevægsmekanik bliver i stigende grad relevant for at få indsigt i, hvordan mekanik påvirker vækstprocesser. Efterhånden som fysiske kræfter formerer sig over betydelige afstande i fast væv, bliver undersøgelsen af ændringer i cellevæggens fysiske egenskaber, og hvordan de sanses, kontrolleres, indstilles og påvirker plantens vækst, et vigtigt fagområde 2,3,8.
En metode præse…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af CSIC I + D 2018, bevilling nr. 95 (Mariana Sotelo Silveira).; CSIC Grupos (Omar Borsani) og PEDECIBA.
1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Include sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock and maintain water balance in living cells. | ||
AFM software | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
Atomic force microscopy (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
Catalyst Probe holder-fluid | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | A probe holder for the Bioscope Catalyst, designed for fluid operation in contact or Tapping Mode. Also compatible with air operation. |
Cryoscopic osmometer; model OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Original concentration, (1962) |
Optical inverted microscope coupled to the AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Neutral, non acidic silicone glue |
Petri dishes | Deltalab | 200201.B | Polystyrene, 55 x 14 mm, radiation sterile. |
Propidium iodide | Sigma | P4170 | For root viability test. |
Silicon nitride probe, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | For force modulation microscopy in liquid operation. Probe tip radius of 20-60 nm. 175-μm-long triangular cantilever, with a spring constant of 0.35 N/m. |
Tweezers | Sigma | T4537 |