Ingeniería de agentes antivirales a través de la resonancia de plasmones de superficie
Summary
El presente protocolo describe nuevas herramientas para ensayos de unión a SPR para examinar la unión CV-N a HA, glicoproteína S, glicanos de tipo híbrido relacionados y oligosacáridos con alto contenido de manosa. SPR se utiliza para determinar el KD para la unión de CV-N dimérico o monomérico a estos glicanos.
Abstract
La resonancia de plasmón de superficie (SPR) se utiliza para medir la unión de hemaglutinina (HA) al dímero de cianovirina-N (CV-N) intercambiado por dominio y para monitorear las interacciones entre los péptidos manosilados y el sitio de unión de alta afinidad de CV-N. Se ha informado que los picos de la envoltura del virus gp120, HA y glicoproteína del Ébola (GP) 1,2 se unen a sitios de unión de alta y baja afinidad en CVN2 dimérico. El péptido HA dimanosilado también se une en los dos sitios de unión de baja afinidad a una molécula diseñada de CVN2, que lleva un sitio de alta afinidad para el ligando respectivo y muta para reemplazar un enlace disulfuro estabilizador en el bolsillo de unión a carbohidratos, confirmando así la unión multivalente. La unión a HA se muestra en un sitio de unión de alta afinidad del pseudoanticuerpo CVN2 a una constante de disociación (KD) de 275 nM que neutraliza aún más el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) a través de la oligomerización. La correlación del número de puentes disulfuro en CVN2 intercambiado de dominio, que se reducen de 4 a 2 mediante la sustitución de cistinas en pares de residuos polares de ácido glutámico y arginina, da como resultado una afinidad de unión reducida a HA. Entre las interacciones más fuertes, el ébola GP1,2 está unido por CVN2 con dos sitios de unión de alta afinidad en el rango nanomolar inferior utilizando el glicano de envoltura sin un dominio transmembrana. En el presente estudio, la unión de la glicoproteína monomérica multiespecífica CV-N al coronavirus 2 del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) se mide en K D = 18.6 μM en comparación con la KD nanomolar a esos otros picos de virus, y a través de su dominio de unión al receptor en el rango medio μ-molar.
Introduction
La actividad antiviral asociada a la teterina es inducida por el interferón-α, y comprende ataduras basadas en proteínas, que conducen a la retención de viriones completamente formados en las superficies celulares infectadas1. La necesidad de glicosilación de la teterina en la inhibición de la liberación del virus sigue siendo incierta, lo que implica la importancia de los patrones de glicosilación en los glicanos expresados recombinantemente para los estudios in vitro 1,2, que depende de la conformación de (en el caso del virus de la gripe) hemaglutinina HA 3,4 de la gripe expresada en superficie (en el caso del virus de la gripe) . Se ha observado que la modificación del oligosacárido atado a la glicosilación ligada a N es suficiente para la restricción mediada por la teterina de la liberación 2 del VIH tipo 1, mientras que la dimerización desempeña un papel esencial en la prevención dela liberación del virus, involucrando así el dominio transmembrana o el anclaje glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) para atar los viriones en ciernes5 . Se describen características únicas para la teterina humana y murina para bloquear múltiples virus, retrovirus y filovirus envueltos. BST-2/teterina es una proteína antiviral inducible por interferón de la inmunidad innata1,6, que actúa con actividad antiviral de amplio espectro y es antagonizada por las glicoproteínas de la envoltura 5 para translocar la teterina o alterar la estructurade la teterina 6. Por ejemplo, la glicoproteína HA de la envoltura expresada en superficie y la neuraminidasa en el virus de la influenza A son bien conocidas por el antagonismo de la teterina de una manera específica de la cepa7, lo que facilita el reconocimiento de los sitios de unión al receptor del huésped8. Los anticuerpos dirigidos a glicanos se estudian en la estequiometría de sus interacciones con los escudos de glicanos que se personalizan rápidamente en HA, lo que resulta en una afinidad de unión a los subtipos4 de influenza A H3N2 y H1N1.
Para dilucidar los mecanismos de unión entre los agentes antivirales y los picos de envoltura del virus, es decir, ligandos de carbohidratos y métodos inmunológicos y espectroscópicos complementarios, se sintetizan químicamente restos mono, di- y trimanosa. Los péptidos manosilados se crean a través de la glicosilación azido de glicosil {beta}-peracetatos a 1,2-trans glicosil azidas transformación9, imitando la N-acetil glucosamina y oligosacáridos con alto contenido de manosa en la superficie de virus potencialmente mortales. Los bioisósteres de triazol se utilizan para imitar los enlaces que forman el residuo manosilado del péptido HA10 y facilitar las interacciones específicas del sitio con derivados antivirales CV-N alrededor del segundo punto de glicosilación ligado a N en el dominio de la cabeza de HA (HA superior con 4 glicanos ligados a N N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Las interacciones entre el ácido glutámico (Glu) y la arginina (Arg) y el dipolo de hélice resultante manifestaron una buena estabilidad tanto de péptidos modelo como de proteínas, pero se visualizan utilizando SPR. Si se compara con el reconocimiento de un único sitio de glicosilación sintetizado químicamente en HA10 mediante la inhibición directa de la unión del receptor en las fracciones de glicanos, se muestra que una mayor afinidad de una estructura Fc mutada de cuatro sitios a su receptor provoca funciones efectoras in vivo, revelando que la composición no relacionada de glicanos ligados a N unidos al mutante Fc se determina mecánicamente13.
CV-N muestra actividad antiviral contra el VIH 14,15, la influenza16 y el virus del Ébola, que está mediada por la unión nanomolar a modificaciones de oligosacáridos con alto contenido de manosa en las proteínas de espiga de la envoltura12,17,18,19. Se determina que la unión de HA de influenza a un sitio de unión a carbohidratos (H) de alta afinidad en CV-N o dos Hs en CVN2 dimérica unida covalentemente tiene constantes de disociación de equilibrio (K D) = 5.7 nM (Figura 1A) y KD = 2.7 nM, respectivamente. Tanto CV-N como CVN2 albergan otros uno o dos sitios de unión a carbohidratos (L) de baja afinidad 12,17,20,21. El ébola GP1,2 se une a 2H de CVN2 con afinidades en el rango nanomolar inferior (KD = 26 nM). La unión CV-N WT al Ébola GP1,2 y HA exhibe afinidades de K D = 34 nM a KD = 5.7 nM (A/New York/55/04)12. Las lectinas, como CV-N, que se dirigen específicamente a los glicanos con alto contenido de manosa en las envolturas virales, inhiben aún más la replicación del virus de la hepatitis C, el SARS-CoV, el herpesvirus, el virus de Marburgo y el virus del sarampión22.
La pequeña molécula CV-N ha sido estudiada a fondo durante más de 20 años, ya que se funcionaliza para unirse a una amplia gama de virus para inhibir la entrada viral16,18. Los análisis estructurales y los ensayos de afinidad de unión indican la reticulación de dos Ls en un dímero CVN2 intercambiado por dominio mediante unión bivalente en el rango micromolar para mejorar la avidez a las glicoproteínas de la envoltura viral10,19. La unión selectiva de Manα1-2Manα en los brazos Man(8) D1D3 y Man(9) comprende dos sitios de unión de diferentes afinidades localizadas en protómeros proteicos opuestos20, alcanzando así afinidades de unión nanomolar (Figura 1B). Por lo tanto, CVN2 se considera un pseudo-anticuerpo en cuanto a su aplicación para unirse a epítopos en el gp120 del VIH, similar a los anticuerpos neutralizantes del virus17. En este documento, el autor está interesado en investigar la posible unión de CVN2 al pico de SARS-CoV-2 a través de su dominio de unión al receptor (RBD). Las curvas de unión de la enzima convertidora de angiotensina humana inmovilizada (ECA)-2 con el RBD del SARS-CoV-2 dan como resultado KD = 4,7 nM para esta interacción de unión biológicamente relevante23.
Por el contrario, las clases seleccionadas de inmunoglobulinas reconocen patrones proteicos estructurales específicos y consistentes, que imparten un sustrato para la maduración de la afinidad en las regiones HA ancladas a la membrana24. CV-N muestra una actividad altamente potente en casi todos los virus de la influenza A y B16, y es un agente antiviral ampliamente neutralizante. Nuestro conocimiento es incompleto sobre la ubicación de epítopos dirigidos en el tallo de HA1 y HA2 que posiblemente involucran estructuras epitópicas para la focalización de glicanos por anticuerpos altamente neutralizantes y en comparación con la unión a lectinas25.
Figura 1: Representación esquemática del ensayo de unión SPR para CV-N a picos de envoltura del virus. (A) Ensayo SPR para la unión de CV-N al ligando: proteína HA de longitud completa (90 kDa). Conjunto de datos cinéticos (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 nM) que muestran la unión de doble referencia en tiempo real a la influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 que se une al ligando inmovilizado DM dentro de un rango de concentración de 500 nM a 16 μM. Secuencia: Los residuos L se resaltan en amarillo. Los residuos H se resaltan en gris. E58 y R73 son un reemplazo para las cisteínas en la proteína de tipo salvaje y hacen de V2 un pliegue de proteína estable con tres enlaces disulfuro en lugar de cuatro Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Mientras que el escudo glicanos en la parte superior de HA distal de membrana induce una unión de alta afinidad a CV-N 12, la unión de CVN2 a HA adyacente a un puente disulfuro de la parte superior de HA se ha observado además en sus sitios de baja afinidad10,12. Varias interacciones polares y sitios de interacción se identifican en la unión de carbohidratos por CV-N. Estas interacciones se verifican mediante la generación de variantes knock-out en el sitio de unión para correlacionar las afinidades de unión con la glicosilación predicha in silico 12. Por lo tanto, el proyecto tiene como objetivo comparar péptidos HA químicamente manosilados previamente probados en afinidad y especificidad de unión con secuencias cortas de péptidos de picos de 2019-nCoV relacionados con el SARS y SARS-CoV-2, que ocurren naturalmente modificados por un pequeño número de diferentes sitios de glicosilación ligados a N y glicosilación ligada a O. Usando microscopía crioelectrónica y ensayos de unión, Pinto y sus colaboradores reportan un anticuerpo monoclonal, S309, que potencialmente reconoce un epítopo en la proteína espiga del SARS-CoV-2 que contiene un glicano conservado dentro del subgénero Sarbecovirus, sin competir con la unión al receptor26. El protocolo de este estudio describe cómo el diseño, la expresión y la caracterización de variantes de CV-N son importantes para estudiar cómo CV-N y CVN2 se unen a proteínas glicosiladas y péptidos manosilados sintéticos utilizando la tecnología SPR10,12.
El dímero ligado en tándem CVN2L027 y las variantes del sitio de unión (V2-V5) se expresan de forma recombinante y las variantes se expresan con reemplazos de enlaces disulfuro (C58E y C73R) (Figura 2A). Además, se prepara un mutante con una mutación de un solo punto E41A porque esta posición se ha visto como un residuo de contacto cruzado intermolecular. Este mutante es otra molécula interesante para las mediciones de unión SPR entre la lectina y los oligosacáridos con alto contenido de manosa que descifran los dominios de unión y permiten la comparación con la forma dimérica. La estructura cristalina intercambiada de dominio de CVN2 muestra un enlazador flexible, que se extiende entre 49 y 54 residuos. Los dos dominios pueden continuar moviéndose alrededor de la bisagra como cuerpos rígidos, desarrollando un monómero a través de interacciones de dominio intramolecular (dominio A -residuos 1-39;90-101- con dominio B -residuos 40-89) o un dímero por intercambio de dominio intermolecular [dominio A (del primer monómero) con dominio B (del segundo), y dominio B (del primer monómero) con dominio A (de la segunda copia)]. No hay interacciones cercanas entre los dominios A y B de los dos protómeros, excepto para Glu4128. El gen para CV-N puede desarrollarse utilizando un método de PCR repetitivo con oligos29 sintetizados de 40 mer y luego se subclona en los sitios NdeI y BamHI de pET11a para su transformación (electroporación) en células electrocompetentes como lo describe Keeffe, J.R.27. La proteína, que se utiliza para lograr la estructura cristalina respectiva (PDB ID 3S3Y), incluye una etiqueta de purificación de 6-histidina N-terminal seguida de un sitio de escisión de la proteasa del factor Xa. La mutagénesis dirigida al sitio se utiliza para hacer mutaciones puntuales, cambiar codones e insertar o eliminar bases o codones únicos o múltiples para el intercambio de aminoácidos. Estas transformaciones proporcionan información invaluable sobre la función y estructura de las proteínas. Los CV-N, CVN2 y CVN3 expresados y purificados recombinantemente han sido biofísicamente bien estudiados20,21,27, son baratos de producir y, por lo tanto, se utilizan para caracterizar ensayos de unión a glicanos inmovilizados en chips sensores SPR. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas convencional (ELISA) proporciona menos reproducibilidad con respecto a la técnica de inmovilización de ligandos de glicano y transforma la unión en tiempo real de varias variantes del sitio de unión, que se muestra para SPR, en ensayos de punto final.
La variante de afinidad de unión CVN2L0-V2 (un pliegue intacto de CV-N homodimérico con una sustitución de puente disulfuro10) se expresa con una etiqueta His en Escherichia coli (E. coli), purificada sobre una columna de Ni-NTA aplicando cromatografía de afinidad y probada para unirse a HA (H3N2), péptido HA monomanosilado y péptido HA dimanosilado usando SPR. Los péptidos químicamente manosilados, o proteína HA y S, todos son ligandos y aminas acoplados a la superficie del chip hidrófilo. a través de ésteres reactivos o ingeniería de proteínas biotina-estreptavidina. El mismo procedimiento de corridas secuenciales se aplica a esos ligandos, inyectando diversas diluciones de CV-N y variantes de CV-N (y CVN2) para obtener información cinética para los análisis de interacción molecular como se describe a continuación30. El chip sensor SPR inmovilizado RBD se utiliza para estudios de unión en péptidos CV-N a S, y las afinidades se comparan con la unión del SARS-CoV-2 con el ACE2 humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
La afinidad de enlace de CV-N se correlaciona con el número de sitios de enlace funcionales [2H en los dominios B y 2L en los dominios A cuando se diseñan como dímeros intercambiados por dominio]. Una variante con una afinidad de unión alterada (CVN2L0-V2, un pliegue homodimérico estable de CV-N que comprende un knock-out de puente disulfuro) se expresa en E. coli, se purifica y se prueba positivamente para unirse a la proteína HA (H3N2) utilizando SPR10, y muestra un cambio conform…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor agradece al Dr. Christian Derntl del Departamento de Biotecnología y Microbiología de la Universidad Técnica de Viena y al Departamento de Medicina III, División de Nefrología y Diálisis de la Universidad Médica de Viena, especialmente al Dr. Markus Wahrmann por su apoyo técnico y científico. La expresión de proteínas en células de mamíferos fue apoyada por el Departamento de Biotecnología de la Universidad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida (BOKU) de Viena. La autora quiere expresar su profundo agradecimiento al Dr. Nico Dankbar de XanTec bioanalytics en Düsseldorf, Alemania, por sus útiles discusiones científicas sobre la realización de los ensayos de unión SPR.
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
References
- Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
- Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
- Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
- Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
- Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
- Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
- Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
- Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
- Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
- Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
- Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
- Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
- Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
- Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
- Bolmstedt, A. J., O’Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
- O’Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
- Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
- Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
- Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
- Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
- Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
- Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
- Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
- Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
- Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
- Fischer, M. J. E., Mol, N., Fischer, M. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 627, (2010).
- Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , 532-535 (2005).
- . QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to (2005)
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- . Expasy.org Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022)
- Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
- Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
- . Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28 Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022)
- Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. 5, 97-141 (2007).
- . Method Development Notes Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022)
- Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. 화학. 16 (26), 7803-7812 (2010).
- Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
- Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).
