Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.
Abstract
A camada de epitélio pigmentado da retina (RPE) fica imediatamente atrás dos fotorreceptores e abriga um complexo sistema metabólico que desempenha vários papéis críticos na manutenção da função dos fotorreceptores. Assim, a estrutura e função RPE são essenciais para sustentar a visão normal. Este manuscrito apresenta um protocolo estabelecido para o isolamento celular RPE do mouse primário. O isolamento rpe é uma ótima ferramenta para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patologia RPE nos diferentes modelos de camundongos de distúrbios oculares. Além disso, o isolamento do RPE pode ajudar na comparação de células RPE do camundongo primário isoladas de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, bem como testar drogas que podem acelerar o desenvolvimento da terapia para distúrbios visuais. O manuscrito apresenta um protocolo de isolamento RPE passo a passo; todo o procedimento, desde a enucleação até a semeadura, leva aproximadamente 4 horas. A mídia não deve ser alterada por 5-7 dias após a semeadura, para permitir o crescimento das células isoladas sem perturbação. Esse processo é seguido pela caracterização da morfologia, pigmentação e marcadores específicos nas células por meio da imunofluorescência. As células podem ser passagemdas no máximo três ou quatro vezes.
Introduction
As células de epitélio pigmentado da retina (RPE) estão localizadas entre o coroide e a retina neural, formando uma monocamada simples de células cuboidais que fica atrás das células fotorreceptoras (PR)1. O RPE desempenha um papel fundamental na manutenção de um ambiente saudável para as células de RP, principalmente pela redução do acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e consequente dano oxidativo1. As células RPE supervisionam muitas funções, como a conversão e armazenamento de retinóides, a absorção de luz dispersa, transporte de fluidos e íons, e fagocitose da membrana do segmento externo 2,3 do galpão PR. Alterações no RPE (morfologia/função) podem prejudicar sua função levando à retinopatia e esta é uma característica comum compartilhada por muitos distúrbios oculares4. Muitas doenças oculares estão associadas a alterações na morfologia e função das células RPE, incluindo algumas doenças genéticas como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber e albinismo 4,5,6, bem como distúrbios oculares relacionados à idade, como retinopatia diabética (DR) e degeneração macular relacionada à idade (AMD)7,8 . As células humanas são as mais desejáveis, portanto seria ideal estudar distúrbios de RPE em células RPE humanas primárias para a formação de monocamadas RPE. No entanto, questões éticas e a limitada disponibilidade de doadores humanos devido ao fato de que a maioria desses transtornos levam à morbidade9, mas não necessariamente a mortalidade10, impedindo assim o isolamento das células RPE humanas primárias. Isso torna a cultivo de células RPE de doadores de animais não humanos uma alternativa preferida. Os roedores, particularmente os camundongos, são considerados um grande modelo para estudar diferentes doenças oculares, uma vez que a tecnologia transgênica é mais amplamente estabelecida nestas espécies11. Embora o uso de células RPE primárias cultivadas ofereça muitas vantagens, tem sido difícil manter células em crescimento por muitas passagens, ou armazenar e reutilizar as células. A principal limitação deste protocolo é a idade dos camundongos; camundongos que são usados para o isolamento de RPE devem ser de uma idade muito jovem (18-21 dias de idade é ideal), pois tem sido difícil cultivar células RPE de camundongos adultos 11,12,13. As células RPE podem ser isoladas dos olhos do rato em qualquer idade, porém até quatro passagens celulares só foram bem sucedidas com camundongos jovens (18-21 dias de idade). O isolamento rpe das retinas do camundongo, utilizando tanto camundongos C57BL6 quanto camundongos transgênicos com exclusão dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs) nas células RPE, foi realizado para estudar o efeito da homocisteína de aminoácido elevado no desenvolvimento e progressão da AMD14. Além disso, células primárias de RPE isoladas ajudaram a propor um alvo terapêutico para AMM pela inibição dos NMDARs nas células RPE14. Existem alguns bloqueadores de NMDAR que são aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) e são atualmente usados para tratar confusão moderada a grave (demência) relacionada à doença de Alzheimer (DA), como a memantina16, que poderia ser um alvo terapêutico potencial para a AMD14. Além disso, células de RPE de camundongos primários isolados foram utilizadas para a detecção de marcadores inflamatórios e a indução proposta de inflamação como um mecanismo subjacente para características induzidas por homocisteína de AMD e AD usando um rato geneticamente modificado (CBS), que apresenta um alto nível de homocisteína16,17.
Este protocolo foi usado para isolar células RPE de camundongos tipo selvagem C57BL/6 e camundongos transgênicos desenvolvidos em nosso laboratório como uma adaptação simplificada de outros protocolos de isolamento publicados 13,18,19 para alcançar um protocolo facilmente aplicável e confiável. Não há preferência sexual neste protocolo. Enquanto as idades dos camundongos são fundamentais para o processo de isolamento, camundongos jovens, idosos (18-21 dias) e camundongos mais velhos em qualquer idade (até 12 meses) foram usados para o isolamento de RPE. No entanto, notamos que as células RPE isoladas dos camundongos jovens viviam mais tempo, e até quatro passagens podiam ser realizadas. As células RPE isoladas de camundongos mais velhos poderiam ser passagemdas uma ou duas vezes, então parariam de crescer a uma taxa normal e mudariam sua forma para serem mais alongadas (células semelhantes a fibroblastos). Também foi observada perda de pigmentação e diminuição da adesão à placa de cultura tecidual seguida de descolamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo atual é um procedimento detalhado relatado, modificado e simplificado para o isolamento de RPE a partir de olhos de rato. O protocolo inclui enucleação, dissecção, coleta, semeadura, cultura e caracterização de células RPE isoladas dos olhos do rato.
Existem algumas limitações e passos críticos que devem ser cumpridos para o isolamento bem sucedido de RPE, como a idade dos ratos, o número de olhos dissecados, o tamanho da placa ou prato da cultura tecidual, e cuidados a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Olhos (NEI), Instituto Nacional de Olhos (NEI) do Fundo R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
References
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