Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши
Summary
Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.
Abstract
Слой пигментированного эпителия сетчатки (RPE) находится непосредственно за фоторецепторами и содержит сложную метаболическую систему, которая играет несколько критических ролей в поддержании функции фоторецепторов. Таким образом, структура и функция RPE необходимы для поддержания нормального зрения. В этой рукописи представлен установленный протокол для первичной изоляции клеток RPE мыши. Изоляция RPE является отличным инструментом для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии RPE в различных мышиных моделях глазных расстройств. Кроме того, изоляция RPE может помочь в сравнении первичных клеток RPE мышей, выделенных у диких и генетически модифицированных мышей, а также в тестировании лекарств, которые могут ускорить разработку терапии зрительных расстройств. В рукописи представлен пошаговый протокол изоляции RPE; вся процедура, от энуклеации до посева, занимает примерно 4 часа. Среда не должна быть изменена в течение 5-7 дней после посева, чтобы обеспечить рост изолированных клеток без нарушения. За этим процессом следует характеристика морфологии, пигментации и специфических маркеров в клетках посредством иммунофлуоресценции. Клетки могут быть пройдены максимум три или четыре раза.
Introduction
Клетки пигментированного эпителия сетчатки (RPE) расположены между сосудистой оболочкой и нервной сетчаткой, образуя простой монослой кубоидальных клеток, который лежит за фоторецепторными (PR) клетками1. RPE играет решающую роль в поддержании здоровой окружающей среды для PR-клеток, главным образом путем уменьшения чрезмерного накопления активных форм кислорода (АФК) и последующего окислительного повреждения1. Клетки RPE контролируют многие функции, такие как преобразование и хранение ретиноидов, поглощение рассеянного света, транспорт жидкости и ионов и фагоцитоз сброшенной PR наружной сегментной мембраны 2,3. Изменения в RPE (морфология / функция) могут ухудшить их функцию, ведущую к ретинопатии, и это общая черта, общая для многих глазных расстройств4. Многие глазные заболевания связаны с изменениями в морфологии и функции клеток RPE, включая некоторые генетические заболевания, такие как пигментный ретинит, врожденный амавроз Лебера и альбинизм 4,5,6, а также возрастные глазные расстройства, такие как диабетическая ретинопатия (DR) и возрастная макулярная дегенерация (AMD)7,8 . Клетки человека являются наиболее желательными, поэтому было бы идеально изучать нарушения RPE в первичных клетках RPE человека для формирования монослоев RPE. Однако этические вопросы и ограниченная доступность человеческих доноров обусловлены тем, что большинство из этих расстройств приводят к заболеваемости9, но не обязательно к смертности10, тем самым предотвращая выделение первичных клеток РПЭ человека. Это делает культивирование клеток RPE от нечеловеческих доноров животных предпочтительной альтернативой. Грызуны, особенно мыши, считаются отличной моделью для изучения различных глазных заболеваний, поскольку трансгенная технология более широко распространена у этих видов11. Несмотря на то, что использование культивируемых первичных клеток RPE предлагает много преимуществ, было трудно поддерживать растущие клетки в течение многих проходов или хранить и повторно использовать клетки. Основным ограничением этого протокола является возраст мышей; мыши, которые используются для изоляции RPE, должны быть очень молодого возраста (оптимально 18-21 день), так как было трудно культивировать клетки RPE у взрослых мышей 11,12,13. Клетки RPE могут быть выделены из глаз мыши в любом возрасте, однако до четырех клеточных проходов были успешными только у молодых мышей (18-21 день). Изоляция RPE от сетчатки мышей с использованием как мышей C57BL6, так и трансгенных мышей с делецией рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDAR) в клетках RPE была выполнена для изучения влияния повышенного уровня аминокислотного гомоцистеина на развитие и прогрессирование AMD14. Кроме того, изолированные первичные клетки RPE помогли предложить терапевтическую мишень для ВМД путем ингибирования NMDAR в клетках RPE14. Существуют некоторые блокаторы NMDAR, которые одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и в настоящее время используются для лечения умеренной и тяжелой путаницы (деменции), связанной с болезнью Альцгеймера (БА), таких как мемантин16, который может быть потенциальной терапевтической мишенью для ВМД14. Кроме того, изолированные первичные мышиные клетки RPE были использованы для обнаружения воспалительных маркеров и предполагаемой индукции воспаления в качестве основного механизма гомоцистеин-индуцированных признаков ВМД и AD с использованием генетически модифицированной мыши (CBS), которая представляет высокий уровень гомоцистеина16,17.
Этот протокол был использован для изоляции клеток RPE как от мышей дикого типа C57BL/6, так и от трансгенных мышей, разработанных в нашей лаборатории в качестве упрощенной адаптации других опубликованных протоколов изоляции 13,18,19 для достижения легко применимого и надежного протокола. В этом протоколе нет предпочтения пола. В то время как возраст мышей имеет решающее значение для процесса изоляции, молодые, пожилые мыши (18-21 день) и пожилые мыши в любом возрасте (до 12 месяцев) использовались для изоляции RPE. Тем не менее, мы заметили, что клетки RPE, выделенные у молодых мышей, жили дольше, и можно было выполнить до четырех проходов. Клетки RPE, выделенные у старых мышей, могут быть пройдены один или два раза, затем они перестанут расти с нормальной скоростью и изменят свою форму, чтобы быть более вытянутыми (фибробластоподобные клетки). Также наблюдалась потеря пигментации и снижение адгезии к тканевой культуральной пластине с последующим отслоением.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол представляет собой отчетную, модифицированную и упрощенную подробную процедуру изоляции RPE от глаз мыши. Протокол включает энуклеацию, рассечение, сбор, посев, культивирование и характеристику клеток RPE, выделенных из глаз мыши.
Существуют некоторые огр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Национального института глаз (NEI), Национального института глаз (NEI) R01 EY029751-04
Materials
| Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | For working enzyme, A |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Media to grow RPE cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete RPE cell culture media |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15750-060 | For complete RPE cell culture media |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | For working enzymes (A&B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | For working enzyme A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | For IF staining |
| Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete RPE cell culture media |
| Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
| Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
| Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
| Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
| Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
| Trypsin EDTA (1x) 0.25% | gibco | 2186962 | For working enzyme B |
| Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
| Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
References
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
- Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
- Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
- Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
- Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
- van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer’s disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
- Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
- Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
- Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020)
- Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
- Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
- Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).
