Bildestyrt bioreaktor for generering av bioingeniør luftveisvev
Summary
Protokollen beskriver en bildeaktivert bioreaktor som tillater selektiv fjerning av det endogene epitelet fra rotterøret og homogen fordeling av eksogene celler på lumenoverflaten, etterfulgt av langsiktig in vitrokultur av cellevevskonstruksjonen.
Abstract
Gjentatt skade på luftveisvev kan svekke lungefunksjonen og forårsake kronisk lungesykdom, for eksempel kronisk obstruktiv lungesykdom. Fremskritt innen regenerativ medisin og bioreaktorteknologier gir muligheter til å produsere lab-dyrkede funksjonelle vevs- og organkonstruksjoner som kan brukes til å screene legemidler, modellsykdom og ingeniørvevserstatninger. Her beskrives en miniatyrisert bioreaktor kombinert med en avbildningsmodalitet som tillater in situ visualisering av de indre lumen av utplantet rottetrachea under in vitro vev manipulasjon og kultur. Ved hjelp av denne bioreaktoren demonstrerer protokollen avbildningsstyrt selektiv fjerning av endogene cellulære komponenter samtidig som den bevarer de iboende biokjemiske egenskapene og ultrastrukturen til luftveisvevsmatrisen. Videre vises leveransen, ensartet distribusjon og påfølgende langvarig kultur av eksogene celler på decellulariserte luftveislumenene med optisk overvåking in situ . Resultatene fremhever at den bildestyrte bioreaktoren potensielt kan brukes til å lette genereringen av funksjonelle in vitro luftveisvev.
Introduction
Luftveienes lysende overflate er foret av et lag epitel som hovedsakelig består av multi-ciliated, klubb, beger og basale stamceller 1,2. Epitellaget fungerer som en primærforsvarsmekanisme i lungen, og fungerer som en biofysisk barriere som beskytter det underliggende luftveisvevet mot inhalerte patogener, partikler eller kjemiske gasser. Det beskytter luftveisvevet via flere mekanismer, inkludert intercellulær tett koblingsdannelse, mucociliary clearance og antimikrobiell og antioksidant sekresjon 3,4. Det defekte luftveisepitelet er forbundet med ødeleggende luftveissykdommer, som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)5, primær ciliary dyskinesi (PCD)6 og cystisk fibrose (CF)7.
Fremskritt innen lunge-på-chip (LOC)-teknologi representerer en mulighet til å studere menneskelig lungeutvikling, modellere ulike lungesykdommer og utvikle nye terapeutiske materialer i tett regulerte in vitro-miljøer . For eksempel kan airway epitel og endotel dyrkes på motsatte sider av en tynn, porøs membran for å etterligne gassen som utveksler lungevev, slik at trofast sykdomsmodellering og legemiddeltesting8. På samme måte er in vitro sykdomsmodeller opprettet for å modellere luftveissykdommer in vitro, som KOLS9 og cystisk fibrose10. Imidlertid er en stor utfordring med LOC-enheter å rekapitulere den komplekse tredimensjonale (3D) arkitekturen til lungevevet og dynamiske cellevevsmatriseinteraksjoner in vitro11.
Nylig har innovative vevsteknikk metoder blitt utviklet som tillater manipulering av ex vivo lungevev12. Ved hjelp av disse metodene kan denuderte allogene eller xenogene vevstransplantasjoner fremstilles ved å fjerne endogene celler fra lungevevet via kjemiske, fysiske og mekaniske behandlinger13. I tillegg gir den bevarte innfødte vevs-ekstracellulære matrisen (ECM) i decellulæriserte lungestillasene de fysio-mimetiske strukturelle, biokjemiske og biomekaniske signalene for implanterte celler for å feste, spre seg og skille14,15.
Her rapporteres et bildestyrt bioreaktorsystem opprettet ved å kombinere LOC- og vevsteknologier for å tillate in vitro vevsmanipulering og kultur av utplantet rottetrakealvev. Ved hjelp av denne luftveisvevbioreaktoren demonstrerer protokollen selektiv fjerning av endogene epitelceller uten å forstyrre de underliggende subepitheliale cellulære og biokjemiske komponentene i luftveisvevet. Vi viser deretter den homogene fordelingen og øyeblikkelig avsetning av de nylig frø eksogene cellene, for eksempel mesenchymale stamceller (MSCs), på denuded airway lumen ved å innpode det cellebelastede kollagenet jeg pre-gel løsning. I tillegg, ved å bruke den mikrooptiske bildeenheten integrert i bioreaktoren, gjøres også visualiseringen av luftrørets lumen under epitelfjerning og endogen cellelevering. Videre er det vist at luftrøret og nylig implanterte celler kan dyrkes i bioreaktoren uten merkbar celledød og vevsforringelse i 4 dager. Vi ser for oss at den bildeaktiverte bioreaktorplattformen, den tynne filmbaserte de-epitelialiseringsteknikken og celleleveringsmetoden som brukes i denne studien, kan være nyttig for å generere luftveisvev for in vitro sykdomsmodellering og legemiddelscreening.
Bioreaktoren inkluderer et rektangulært kammer koblet til en programmerbar sprøytepumpe, perfusjonspumpe og ventilator for dyrking av isolert rottetreksett. Bioreaktoren har innløp og uttak koblet til luftrøret eller vevskulturkammeret for å levere reagenser separat (f.eks. kulturmedier) til de indre og ytre områdene i luftrøret (figur 1). Et spesialbygd bildebehandlingssystem kan brukes til å visualisere det indre av den in vitrokulturerte rotterøret på cellenivå (figur 2). Det endogene epitelet i luftrøret fjernes ved innånding av en vaskemiddelbasert decellulariseringsløsning etterfulgt av vibrasjonsassistert luftveisvask (figur 3). Hydrogelløsning, for eksempel type I kollagen, brukes som leveringskjøretøy for såing av eksogene celler jevnt og øyeblikkelig over den denuded trachea lumen (figur 4). Alle materialene som brukes til å konstruere bioreaktoren og utføre forsøkene er gitt i materialtabellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet opprettet vi en bildestyrt bioreaktor som kan tillate (i) overvåking av luftrøret lumen in situ etter cellefjerning og eksogen cellelevering og (ii) langsiktig in vitrokultur av cellefrø luftrøret vev. Ved hjelp av denne spesialbygde bioreaktoren demonstrerte vi (i) selektiv fjerning av de endogene epitelcellene fra luftrørets lumen ved hjelp av vaskemiddel og vibrasjonsassistert luftveisvask og (ii) jevn fordeling av eksogene celler på lysflaten til den denuderte luftrøret ved h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen har delvis blitt støttet av American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation og National Science Foundation (CAREER Award 2143620) til J.K.; og National Institutes of Health (P41 EB027062) til G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
