Vi presenterer en protokoll for isolering og frysefraktur av ekstracellulære vesyrer (ELBILER) som stammer fra kreftfremkallende urotelceller. Frysefrakturteknikken avslørte ELBIL-enes diameter og form og-som en unik funksjon – den interne organiseringen av EV-membranene. Disse er av enorm betydning for å forstå hvordan elbiler samhandler med mottakermembranene.
Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbegrensede strukturer som frigjøres fra cellene inn i det ekstracellulære rommet og er involvert i intercellulær kommunikasjon. Elbiler består av tre populasjoner av vesicles, nemlig mikrovesicles (MVs), exosomes og apoptotic kropper. Den begrensende membranen til elbiler er avgjørende involvert i samspillet med mottakercellene, noe som kan føre til overføring av biologisk aktive molekyler til mottakercellene og følgelig påvirke deres oppførsel. Frysefrakturelektronmikroskopiteknikken brukes til å studere den interne organiseringen av biologiske membraner. Her presenterer vi en protokoll for MV-isolasjon fra kultiverte kreftceller og frysebrudd av MVs i trinnene for rask frysing, oppsprekking, produksjon og rengjøring av kopiene, og analysere dem med overføringselektronmikroskopi. Resultatene viser at isolasjonsprotokollen gir en homogen populasjon av elbiler, som tilsvarer formen og størrelsen på MVs. Intramembrane partikler finnes hovedsakelig i protoplasmatisk ansikt av den begrensende membranen. Derfor er frysebrudd den valgte teknikken for å karakterisere MVs diameter, form og fordeling av membranproteiner. Den presenterte protokollen gjelder for andre populasjoner av elbiler.
Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbegrensede vesikler som frigjøres fra celler til det ekstracellulære rommet. De tre viktigste populasjonene av elbiler er eksosomer, mikrovesicles (MVs) og apoptotiske kropper, som varierer i opprinnelse, størrelse og molekylær sammensetning 1,2,3. Sammensetningen av elbiler gjenspeiler donorcellens molekylære profil og dens fysiologiske status (dvs. sunn eller syk)4,5. Dette gir elbiler et enormt potensial i diagnostisering, prognose og terapi av menneskelige sykdommer, og de har lovende medisinske applikasjoner for bruk i persontilpasset medisin 6,7,8.
Elbiler er meglere av intercellulær kommunikasjon. De inneholder biologisk aktive proteiner, lipider og RNAer, som forstyrrer biologiske prosesser i mottakercellen og kan endre sin oppførsel 9,10. Sammensetningen av EV-begrensende membran er imidlertid avgjørende for samspillet med mottakercellemembranen.
Kildene til elbiler er kroppsvæsker og betingede kulturmedier. For å isolere en EV-populasjon må det brukes en egnet isolasjonsteknikk. For eksempel gir sentrifugering ved 10.000 × g en brøkdel beriket i MVs, mens sentrifugalkrefter på ≥ 100.000 × g gir en brøkdel beriket i eksosomer11,12. Den isolerte brøkdelen av elbiler må valideres når det gjelder renhet, størrelse og form. Til dette formålet anbefalte International Society for Extracellular Vesicles 2018 tre klasser av høyoppløselige bildeteknikker: elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi og lysmikroskopibasert superoppløselig mikroskopi13. Ingen av disse teknikkene kan gi informasjon om EV-membranens interiør.
Frysefraktur elektronmikroskopi er en teknikk for å bryte frosne prøver for å avsløre sine indre strukturer, spesielt med tanke på membraninteriøret. Trinnene for prøvepreparering er (1) rask frysing, (2) oppsprekking, (3) som lager replikaen, og (4) rengjøring av replikaen14. I trinn 1 er prøven (valgfritt) kjemisk festet, kryoprekket med glyserol og frosset i flytende freon. I trinn 2 er den frosne prøven oppsprukket i en frysefrakturenhet, som eksponerer det indre av membranen bilayer. I trinn 3 skygges de eksponerte oppsprukne ansiktene med platina (Pt) og karbon (C) for å produsere kopier. I trinn 4 fjernes det organiske materialet. Kopien analyseres i transmisjonselektronmikroskopet (TEM). For nøyaktig tolkning av mikrografene må man følge retningslinjer for riktig orientering14,15. Kort sagt er skyggenes retning i mikrografen en referanse for å orientere mikrografen (dvs. for å bestemme retningen av Pt-skyggelegging) og følgelig å bestemme konvekse og konkave former (figur 1). To innvendige visninger kalt oppsprukne ansikter av membranen bilayer kan sees som et resultat av splitting av membranen ved frys-oppsprekking: det protoplasmiske ansiktet (P-ansikt) og det eksoplasmiske ansiktet (E-ansikt). P-ansiktet representerer membranbrosjyren ved siden av celleprotoplasma, mens E-ansiktet representerer membranbrosjyren ved siden av det ekstracellulære rommet. Integrale membranproteiner og deres assosiasjoner blir sett på som fremspringende intramembranpartikler14,15.
Her er målet å bruke frysefrakturteknikken for å karakterisere MVs når det gjelder størrelse, form og strukturen til deres begrensende membran. Her presenterer vi en protokoll for isolering og frysefraktur av MVs som stammer fra humane invasive blærekreftøse urotelceller.
Karakteriseringen av MVs, eller en annen befolkning av isolerte elbiler, er av største betydning til å begynne med før du starter nedstrømsanalyser som “omics” studier eller funksjonelle studier11,18. Heri ble elbiler fra human invasiv blærekreft urotelial T24-celler isolert ved sentrifugering, og etter den medfølgende protokollen for analyse ved frysefrakturelektronmikroskopi viste vi at den isolerte fraksjonen ble beriket i MVs11,13. Isolering av MVs var blottet for cellerester eller organeller, og bekreftet en vellykket isolasjons- og renseprotokoll.
Kombinasjonen av kjemisk fiksering og frysing, som er kritiske trinn i protokollen, beholdt den sfæriske formen på ELBILER12. Forholdsregler er imidlertid nødvendig ved vurdering av EV-diameter ved frys-oppsprekking17. Siden bruddet passerer gjennom prøven tilfeldig, deles MV-membraner inn i deres ekvatoriale og ikke-ekvatoriale plan. For å gi en streng metode for å analysere bildene av frysefrakturerte og skyggelagte prøver, viste Hallett et al. at gjennomsnittlig vesicle diameter er 4/π ganger den faktiske størrelsen på den biliske diameteren på bildet17. Når det gjelder dette, ble elbiler fra T24-celler beregnet til å ha en diameter på 304 nm, som passer i MVs teoretiske størrelsesfordelingsområde på 100-1000 nm19.
Frysefraktur kan supplere negativ farging, den mest brukte TEM-teknikken for å visualisere elbiler. Ved negativ farging er prøven ofte kjemisk festet, tørket og festet til et TEM-rutenett, og kontrastert med uranyloppløsning. Uten støttende medier har elbiler en tendens til å kollapse, noe som gir dem et koppformet utseende. Ved frys-oppsprekking viser vi at MVs er sfærer, noe som gjenspeiler deres form i ekstracellulære rom og kroppsvæsker12. Med det er våre resultater også i samsvar med observasjoner av elbiler i kryo-ultratynneseksjoner 20.
En avgjørende fordel med frysefrakturteknikken er dens evne til å løse den interne organiseringen av den begrensende membranen, som er en nøkkelfaktor for å forstå hvordan elbiler er målrettet mot og samhandler med mottakermembraner. Her analyserte vi membranene til MVs, men frysefraktur kunne avsløre membranorganisasjonen til en hvilken som helst annen befolkning av elbiler. MVs dannes av plasmamembran spirende; Derfor forventes plasmamembranproteiner og proteinklynger å bli funnet i MV-membranen. Våre resultater støttet at MVene fra T24-cellene inneholdt intramembranpartikler, og presenterte integrerte membranproteiner. Basert på partikkelfordeling mellom E-ansiktet og P-ansiktet, er det rimelig å forvente at partiklene som observeres i MVs er transmembrane proteiner uroplakins, som er urothelial cellespesifikke21,24. De observerte partiklene var sparsommelige, noe som er i samsvar med tidligere studier som rapporterte en reduksjon i uroplakins under urothelial karsinogenese 21,22,23. For å undersøke proteinsammensetningen av MV-membraner ytterligere, anbefales imidlertid bruk av frysefraktur-kopi immunmerking (FRIL) -teknikken. FRIL er en oppgradering av den presenterte frysefrakturteknikken og er dedikert til å avsløre identiteten til proteiner i kopier ved antistoffgjenkjenning24,25. For å oppsummere er frysefrakturteknikken en elektronmikroskopiteknikk som er egnet for karakterisering av EV-begrensende membran, samt formen, størrelsen og renheten til de isolerte EV-fraksjonene. Den presenterte protokollen kan også brukes til vurdering av andre populasjoner av isolerte elbiler; Derfor fortjener frysefrakturteknikken inkludering i International Society for Extracellular Vesicles retningslinjer for studier som utforsker organiseringen av EV-begrensende membraner.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Det slovenske forskningsbyrået (forskningskjernefinansieringsnr. P3-0108 og prosjekt J7-2594) og MRIC UL IP-0510 Infrastrukturprogram. Dette arbeidet bidrar til COST Action CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), støttet av COST (European Cooperation in Science and Technology). Forfatterne vil takke Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič og Sabina Železnik for teknisk hjelp med cellekulting og klargjøring av prøvene og Marko Vogrinc, Ota Širca Roš og Nejc Debevec for teknisk hjelp til å forberede videoen.
A-DMEM | ThermoFisher Scientific, USA | 12491015 | |
Balzers freeze-fracture device | Balzers AG, Liechtenstein | Balzers BAF 200 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | model 5810R | |
CO2 incubator HeraCell | Heraues, Germany | ||
Copper carriers | Balzers | BB 113 142-2 | 100+ mesh |
Copper grids | SPI, United States | 2010C | |
Culture flask T75 | TPP, Switzerland | growing surface 75 cm2 | |
F12 (HAM) | Sigma-Aldrich, Germany | 21765029 | |
FBS | Gibco, Life Technologies, USA | 10500064 | |
Glazed Porcelain Plate 6 Well | Fischer Sientific, United States | 50-949-072 | |
Glycerol | Kemika, Croatia | 711901 | final concentration 30 % (v/v) |
Glutaradehyde | Serva, Germany | 23114.01 | final concentration 2.5 % (v/v) |
GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 35050-079 | final concentration 4 mM |
Penicillin | Gibco, Life Technologies | 15140163 | final concentration 100 U/ml |
Phase-contast inverted microscope | Nikon, Japan | model Eclipse | |
Rotor | Eppendorf, Germany | A 4-44 | |
Rotor | Eppendorf, Germany | F-34-6-38 | |
Serological pipetts | TPP, Switzerland | 50mL volume | |
Sodium hypochloride solution in water | Carlo Erba, Italy | 481181 | |
Stereomicroscope | Leica, Germany | ||
Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 35050038 | final concentration 100 mg/mL |
Transmission electron microscope | Philips, The Netherlands | model CM100 | working at 80 kV |
Tweezers | SPI, United States |