المشاركة في زراعة الأعضاء الظهارية في الأمعاء الدقيقة الفئرانية مع الخلايا اللمفاوية الفطرية
Summary
يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئرانية ، وعزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1 من الأمعاء الدقيقة الفئرانية الصفيحة propria، وإنشاء مزارع مشتركة ثلاثية الأبعاد (3D) بين كلا النوعين من الخلايا لدراسة التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا الظهارية المعوية والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1.
Abstract
توفر الثقافات المشتركة المعقدة للعضويات مع الخلايا المناعية أداة متعددة الاستخدامات لاستجواب التفاعلات ثنائية الاتجاه التي تدعم التوازن الدقيق للتوازن المخاطي. تقدم هذه الأنظمة متعددة الخلايا 3D نموذجا اختزاليا لمعالجة الأمراض متعددة العوامل وحل الصعوبات التقنية التي تنشأ عند دراسة أنواع الخلايا النادرة مثل الخلايا اللمفاوية الفطرية المقيمة في الأنسجة (ILCs). تصف هذه المقالة نظام الفئران الذي يجمع بين عضويات الأمعاء الدقيقة والأمعاء الدقيقة الصفيحة البروبريا المشتقة من النوع 1 من النوع 1 (ILC1s) ، والتي يمكن توسيعها بسهولة لتشمل مجموعات ILC أو مجموعات المناعة الأخرى. والمجتمعات الأصلية والمحلية هي مجموعة سكانية مقيمة في الأنسجة يتم إثراؤها بشكل خاص في الغشاء المخاطي، حيث تعزز التوازن وتستجيب بسرعة للضرر أو العدوى. وقد بدأت بالفعل الثقافات العضوية المشتركة مع المجتمعات الأصلية والمحلية في تسليط الضوء على وحدات الإشارات الظهارية المناعية الجديدة في الأمعاء، مما يكشف عن كيفية تأثير المجموعات الفرعية المختلفة ل ILC على سلامة الحاجز الظهاري المعوي وتجديده. سيمكن هذا البروتوكول من إجراء مزيد من التحقيقات في التفاعلات المتبادلة بين الخلايا الظهارية والمناعية ، والتي لديها القدرة على توفير رؤى جديدة حول آليات التوازن المخاطي والالتهاب.
Introduction
التواصل بين الظهارة المعوية والجهاز المناعي المقيم في الأمعاء أمر أساسي للحفاظ على التوازن المعوي1. ترتبط اضطرابات هذه التفاعلات بكل من الأمراض المحلية والجهازية ، بما في ذلك مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطانات الجهاز الهضمي2. مثال بارز على أحد المنظمين الحاسم للتوازن الذي تم وصفه مؤخرا يأتي من دراسة الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILCs) ، والتي برزت كلاعبين رئيسيين في المشهد المناعي المعوي3. ILCs هي مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية غير المتجانسة التي تنظم التوازن المعوي وتنظم الالتهاب إلى حد كبير من خلال إشارات بوساطة السيتوكين4.
تنقسم ILCs Murine على نطاق واسع إلى أنواع فرعية تستند إلى عامل النسخ والمستقبل وملامح التعبير عن السيتوكين5. يتم تعريف ILCs من النوع 1 ، والتي تشمل الخلايا القاتلة الطبيعية السامة للخلايا (NK) و ILCs الشبيهة بالنوع 1 الشبيهة بالمساعدة (ILC1s) ، من خلال التعبير عن عامل النسخ (eomesodermin) Eomes وبروتين T-box المعبر عنه في الخلايا التائية (T-bet)6 ، على التوالي ، والسيتوكينات المفرزة المرتبطة بمناعة T helper type-1 (TH1): الإنترفيرون γ (IFNγ) وعامل نخر الورم (TNF) ، استجابة للإنترلوكين (IL)-12 ، IL-15 و IL-187. أثناء التوازن ، تفرز ILC1s المقيمة في الأنسجة β عامل النمو التحويلي (TGF-β) لدفع الانتشار الظهاري وإعادة تشكيل المصفوفة8. تستجيب ILCs من النوع 2 (ILC2s) في المقام الأول لعدوى الديدان الطفيلية عن طريق إفراز السيتوكينات المرتبطة بمساعد T من النوع 2 (TH2): IL-4 و IL-5 و IL-13 ، وتتميز بالتعبير عن مستقبلات يتيمة مرتبطة بحمض الريتينويك (ROR) α (ROR-α)9 وبروتين GATA الملزم 3 (GATA-3)10,11,12 . في الفئران ، تتميز ILC2s المعوية “الالتهابية” بالتعبير عن مستقبلات تشبه الليكتين في الخلايا القاتلة (الفصيلة الفرعية G member 1 ، KLRG)13 حيث تستجيب للخلية الظهارية المشتقة IL-2514,15. وأخيرا، تعتمد ILCs من النوع 3، والتي تشمل الخلايا المحفزة للأنسجة اللمفاوية و ILCs الشبيهة بالنوع 3 (ILC3s)، على عامل النسخ ROR-γt16، وتتجمع في مجموعات تفرز إما عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة (GM-CSF) ، IL-17 ، أو IL-22 استجابة لإشارات IL-1β و IL-23 المحلية17. تتجمع الخلايا المحفزة للأنسجة اللمفاوية في بقع باير وهي ضرورية لتطوير هذه الأعضاء اللمفاوية الثانوية أثناء التطور18 ، في حين أن ILC3s هي النوع الفرعي ILC الأكثر وفرة في الأمعاء الدقيقة الفئران البالغة الصفيحة propria. تم تسخير أحد أقدم أنظمة الزراعة العضوية المعوية الفئرانية المشتركة مع ILC3s لفصل تأثير السيتوكين IL-22 على محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT-3) بوساطة تكرار الليوسين الغني بالضوء الذي يحتوي على G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + تكاثر الخلايا الجذعية المعوية19 ، وهو مثال قوي على التفاعل الظهاري ILC التجديدي. تظهر ILCs عدم تجانس البصمة بين الأعضاء 20,21 وتظهر اللدونة بين المجموعات الفرعية استجابة للسيتوكينات المستقطبة22. ما الذي يدفع هذه البصمات الخاصة بالأنسجة والاختلافات في اللدونة ، وما هو الدور الذي تلعبه في الأمراض المزمنة مثل IBD23 ، تظل موضوعات مثيرة يمكن معالجتها باستخدام الثقافات العضوية المشتركة.
ظهرت المواد العضوية المعوية كنموذج ناجح وموثوق به لدراسة الظهارة المعوية24,25. يتم إنشاؤها عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية Lgr5 + ، أو الخبايا المعزولة بأكملها ، والتي تشمل خلايا Paneth كمصدر داخلي لعضو عائلة Wnt 3A (Wnt3a). يتم الحفاظ على هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد إما في الهيدروجيل الاصطناعي26 أو في المواد الحيوية التي تحاكي الصفيحة القاعدية propria، على سبيل المثال، مصفوفة القاعدية خارج الخلية (TBEM) المتشابكة حراريا (TBEM)، ويتم استكمالها بشكل أكبر بعوامل النمو التي تحاكي المكانة المحيطة، وأبرزها عامل النمو الظهاري (EGF)، ومثبط البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) Noggin، و Lgr5-ligand و Wnt-ناهض R-Spondin127 . في ظل هذه الظروف ، تحافظ المواد العضوية على القطبية الظهارية القاعدية وتلخص بنية الزغابات المشفرة للظهارة المعوية مع سراديب الخلايا الجذعية الناشئة التي تتمايز نهائيا إلى خلايا امتزازية وإفرازية في وسط العضوية ، والتي تسقط بعد ذلك في الزائفة الداخلية بواسطة anoikis28. على الرغم من أن المواد العضوية المعوية وحدها كانت مفيدة للغاية كنماذج اختزالية للتطور الظهاري وديناميكياته بمعزل عن 29,30 ، إلا أنها تحمل إمكانات مستقبلية هائلة لفهم كيفية تنظيم هذه السلوكيات أو التأثير عليها أو حتى تعطيلها بواسطة المقصورة المناعية.
في البروتوكول التالي ، يتم وصف طريقة للزراعة المشتركة بين الفئران العضوية المعوية الصغيرة والصفيحة المشتقة من ILC1s ، والتي تم استخدامها مؤخرا لتحديد كيف يقلل هذا السكان بشكل غير متوقع من البصمات المعوية للالتهاب ويساهم بدلا من ذلك في زيادة الانتشار الظهاري عبر TGF-β في هذا النظام8.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طرق إنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئرانية ، وعزل ILC1 النادر عن طريق تقليل فقدان الخلايا الليمفاوية أثناء بروتوكول التفكك المعوي ، وإنشاء ثقافات مشتركة بين هاتين المقصورتين. هناك العديد من الخطوات لهذا البروتوكول ، وفي حين أن بعضها خاص ب ILC1s ، يمكن تطبيق هذا النهج على أن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف E.R. بزمالة الدكتوراه من Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). تعترف G.M.J. بزمالة الدكتوراه من Wellcome Trust (203757/Z/16/A). تعترف العاصمة بحصولها على درجة الدكتوراه من المعهد الوطني لحقوق الإنسان GST BRC. تعترف J.F.N. بزمالة Marie Skłodowska-Curie ، وزمالة King’s Prize ، وزمالة RCUK / UKRI Rutherford Fund (MR / R024812/1) ، وجائزة البذور في العلوم من Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). كما نشكر الفريق الأساسي لقياس التدفق الخلوي BRC ومقره في مستشفى غاي. كانت الفئران الصحفية Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 هدية سخية من G. Eberl (معهد باستور، باريس، فرنسا). CD45.1 C57BL/6 تم تقديم الفئران من قبل T. Lawrence (King’s College London ، لندن) و P. Barral (King’s College London ، لندن).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
References
- Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
- Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
- Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
- Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
- Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
- Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
- Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
- Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
- Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
- Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
- Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
- Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
- Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
- Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
- Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
- Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
- Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. 발생학. 420 (2), 262-270 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
- Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
- Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).
