Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til etablering af murine tyndtarmsorganoider, isolering af medfødte lymfoidceller af type 1 fra murine tyndtarmen lamina propria og etablering af 3-dimensionelle (3D) co-kulturer mellem begge celletyper for at studere tovejsinteraktioner mellem tarmepitelceller og type 1 medfødte lymfoide celler.
Komplekse co-kulturer af organoider med immunceller giver et alsidigt værktøj til at forhøre de tovejs interaktioner, der understøtter den delikate balance i slimhindehomeostase. Disse 3D, multicellulære systemer tilbyder en reduktionistisk model til håndtering af multifaktorielle sygdomme og løsning af tekniske vanskeligheder, der opstår, når man studerer sjældne celletyper såsom vævsresidente medfødte lymfoide celler (ILC’er). Denne artikel beskriver et murinsystem, der kombinerer tyndtarmsorganoider og tyndtarm lamina propria afledt hjælperlignende type 1 ILC’er (ILC1’er), som let kan udvides til andre ILC- eller immunpopulationer. ILC’er er en vævsbeboerpopulation, der er særligt beriget i slimhinden, hvor de fremmer homeostase og hurtigt reagerer på skade eller infektion. Organoide co-kulturer med ILC’er er allerede begyndt at kaste lys over nye epitel-immune signalmoduler i tarmen, hvilket afslører, hvordan forskellige ILC-delmængder påvirker tarmepitelbarrierens integritet og regenerering. Denne protokol vil muliggøre yderligere undersøgelser af gensidige interaktioner mellem epitel- og immunceller, som har potentiale til at give ny indsigt i mekanismerne for slimhindehomeostase og inflammation.
Kommunikation mellem tarmepitelet og tarm-resident immunforsvaret er centralt for opretholdelsen af intestinal homeostase1. Forstyrrelser i disse interaktioner er forbundet med både lokale og systemiske sygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og gastrointestinale kræftformer2. Et bemærkelsesværdigt eksempel på en nyere beskrevet kritisk regulator af homeostase kommer fra undersøgelsen af medfødte lymfoide celler (ILC’er), der er opstået som nøgleaktører i tarmimmunlandskabet3. ILC’er er en gruppe heterogene medfødte immunceller, der regulerer intestinal homeostase og orkestrerer inflammation stort set gennem cytokinmedieret signalering4.
Murine ILC’er er bredt opdelt i undertyper baseret på transkriptionsfaktor,receptor og cytokinekspressionsprofiler5. Type-1 ILC’er, som omfatter cytotoksiske Natural Killer (NK) celler og hjælperlignende type-1 ILC’er (ILC1’er), defineres ved ekspression af transkriptionsfaktoren (eomesodermin) Eomes og T-box protein udtrykt i henholdsvis T-celler (T-bet)6 og udskiller cytokiner forbundet med T-hjælper type-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) og tumornekrosefaktor (TNF) som reaktion på interleukin (IL)-12, IL-15 og IL-187. Under homeostase udskiller vævsresidente ILC1’er Transforming Growth Factor β (TGF-β) for at drive epitelproliferation og matrix-ombygning8. Type-2 ILC’er (ILC2’er) reagerer primært på helminthinfektion via sekretion af T-hjælper type-2 (TH2) associerede cytokiner: IL-4, IL-5 og IL-13 og er karakteriseret ved ekspression af retinsyrerelateret forældreløs receptor (ROR) α (ROR-α)9 og GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos mus karakteriseres intestinale “inflammatoriske” ILC2’er yderligere ved ekspression af Killer cell lectin-lignende receptor (underfamilie G-medlem 1, KLRG)13, hvor de reagerer på epiteltuftcelle afledt IL-2514,15. Endelig er type-3 ILC’er, som omfatter lymfoide vævsinducerceller og hjælperlignende type-3 ILC’er (ILC3’er), afhængige af transkriptionsfaktoren ROR-γt16 og klynger sig i grupper, der udskiller enten Granulocyt Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som reaktion på lokale IL-1β- og IL-23-signaler17. Lymfoide vævsinducerceller klynger sig i Peyers patches og er afgørende for udviklingen af disse sekundære lymfoide organer under udvikling18, mens ILC3’er er den mest rigelige ILC-undertype i den voksne murine tyndtarm lamina propria. Et af de tidligste murine intestinale organoide co-kultursystemer med ILC3’er blev udnyttet til at drille virkningen af cytokinet IL-22 på signaltransducer og aktivator af transkription 3 (STAT-3) medieret leucinrig gentagelse indeholdende G-proteinkoblet receptor 5 (Lgr5) + intestinal stamcelleproliferation19, et stærkt eksempel på en regenerativ ILC-epitelinteraktion. ILC’er udviser aftryk-heterogenitet mellem organer20,21 og udviser plasticitet mellem delmængder som reaktion på polariserende cytokiner22. Hvad der driver disse vævsspecifikke aftryk og plasticitetsforskelle, og hvilken rolle de spiller i kroniske sygdomme som IBD23, forbliver spændende emner, der kan behandles ved hjælp af organoide co-kulturer.
Tarmorganoider har vist sig som en vellykket og pålidelig model til at studere tarmepitelet24,25. Disse genereres ved dyrkning af tarmepitel Lgr5+ stamceller eller hele isolerede krypter, som omfatter Paneth-celler som en endogen kilde til Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Disse 3D-strukturer opretholdes enten i syntetiske hydrogeler26 eller i biomaterialer, der efterligner den basale lamina propria, for eksempel Termisk tværbinding basal ekstracellulær matrix (TBEM), og suppleres yderligere med vækstfaktorer, der efterligner den omgivende niche, især epitelvækstfaktor (EGF), knoglemorfogenetisk protein (BMP)-hæmmer Noggin og en Lgr5-ligand og Wnt-agonist R-Spondin127 . Under disse betingelser opretholder organoider epitel-apico-basal polaritet og rekapitulerer krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirende stamcellekrypter, der terminalt differentierer sig til absorberende og sekretoriske celler i midten af organoidet, som derefter kaster ind i det indre pseudolumen ved anoikis28. Selvom tarmorganoider alene har været enormt fordelagtige som reduktionistiske modeller for epiteludvikling og dynamik isoleret29,30, har de et enormt fremtidigt potentiale for at forstå, hvordan denne adfærd reguleres, påvirkes eller endda forstyrres af immunrummet.
I den følgende protokol beskrives en metode til co-kultur mellem murine tyndtarmsorganoider og lamina propria afledte ILC1’er, som for nylig blev brugt til at identificere, hvordan denne population uventet reducerer intestinale signaturer af inflammation og i stedet bidrager til øget epitelproliferation via TGF-β i dette system8.
Denne protokol beskriver metoderne til etablering af murine tyndtarmsorganoider, isolering af sjældne ILC1 ved at minimere tabet af lymfocytter under tarmsociationsprotokollen og etablere co-kulturer mellem disse to rum. Der er mange trin i denne protokol, og mens nogle er specifikke for ILC1’er, kan denne tilgang anvendes på andre intestinale immuncelletyper, og co-kulturopsætninger kan modulært tilpasses til individuelle forskningsspørgsmål. Flere kritiske trin (som anbefales ikke at afvige fra) samt fejlfindings…
The authors have nothing to disclose.
E.R. anerkender et ph.d.-stipendium fra Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. anerkender et ph.d.-stipendium fra Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). DC anerkender en ph.d. studerende fra NIHR GSTT BRC. J.F.N. anerkender et Marie Skłodowska-Curie-stipendium, et King’s Prize-stipendium, et RCUK/UKRI Rutherford Fund-stipendium (MR/R024812/1) og en Seed Award in Science fra Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi takker også BRC flow cytometri kerneteamet baseret på Guy’s Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermus var en generøs gave fra G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrig). CD45.1 C57BL/6 mus blev venligst givet af T. Lawrence (King’s College London, London) og P. Barral (King’s College London, London).
Reagents | |||
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
Percoll | Cytiva | 17089101 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
Plastics | |||
50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
Ice box | – | – | |
Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
Wet ice | – | – |