Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées
Summary
Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.
Abstract
Les co-cultures complexes d’organoïdes avec des cellules immunitaires fournissent un outil polyvalent pour interroger les interactions bidirectionnelles qui sous-tendent l’équilibre délicat de l’homéostasie muqueuse. Ces systèmes multicellulaires 3D offrent un modèle réductionniste pour traiter les maladies multifactorielles et résoudre les difficultés techniques qui surviennent lors de l’étude de types de cellules rares telles que les cellules lymphoïdes innées (ILC) résidant dans les tissus. Cet article décrit un système murin qui combine des organoïdes de l’intestin grêle et des ILC de type 1 dérivés de la lamina propria de l’intestin grêle, qui peuvent être facilement étendus à d’autres ILC ou populations immunitaires. Les ILC sont une population résidant dans les tissus qui s’enrichit particulièrement dans la muqueuse, où ils favorisent l’homéostasie et réagissent rapidement aux dommages ou aux infections. Les co-cultures organoïdes avec des ILC ont déjà commencé à mettre en lumière de nouveaux modules de signalisation épithéliale-immunitaire dans l’intestin, révélant comment différents sous-ensembles d’ILC affectent l’intégrité et la régénération de la barrière épithéliale intestinale. Ce protocole permettra d’approfondir les recherches sur les interactions réciproques entre les cellules épithéliales et immunitaires, qui ont le potentiel de fournir de nouvelles informations sur les mécanismes de l’homéostasie muqueuse et de l’inflammation.
Introduction
La communication entre l’épithélium intestinal et le système immunitaire résident de l’intestin est essentielle au maintien de l’homéostasie intestinale1. Les perturbations de ces interactions sont associées à des maladies locales et systémiques, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et les cancers gastro-intestinaux2. Un exemple notable d’un régulateur critique de l’homéostasie décrit plus récemment provient de l’étude des cellules lymphoïdes innées (ILC), qui sont devenues des acteurs clés du paysage immunitaire intestinal3. Les ILC sont un groupe de cellules immunitaires innées hétérogènes qui régulent l’homéostasie intestinale et orchestrent l’inflammation en grande partie par la signalisation médiée par les cytokines4.
Les ILC murins sont largement divisés en sous-types en fonction des profils d’expression du facteur de transcription, des récepteurs et des cytokines5. Les ILC de type 1, qui comprennent les cellules cytotoxiques Natural Killer (NK) et les ILC de type auxiliaire de type 1 (ILC1s), sont définis par l’expression du facteur de transcription (eomesodermine) Eomes et de la protéine T-box exprimées dans les lymphocytes T (T-bet)6, respectivement, et sécrètent des cytokines associées à l’immunité T helper de type 1 (TH1) : interféron-γ (IFNγ) et facteur de nécrose tumorale (TNF), en réponse à l’interleukine (IL)-12, IL-15 et IL-187. Au cours de l’homéostasie, les ILC1 résidant dans les tissus sécrètent des β transformant le facteur de croissance (TGF-β) pour stimuler la prolifération épithéliale et le remodelage de la matrice8. Les ILC de type 2 (ILC2) répondent principalement à l’infection par les helminthes par la sécrétion de cytokines associées au T helper de type 2 (TH2) : IL-4, IL-5 et IL-13, et sont caractérisées par l’expression du récepteur orphelin (ROR) lié à l’acide rétinoïque α (ROR-α)9 et de la protéine de liaison GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Chez la souris, les ILC2 « inflammatoires » intestinaux sont en outre caractérisés par l’expression du récepteur de type lectine des cellules tueuses (sous-famille G membre 1, KLRG)13 où ils répondent à l’IL-2514,15 dérivée des cellules épithéliales de la touffe. Enfin, les ILC de type 3, qui comprennent les cellules inductrices du tissu lymphoïde et les ILC de type 3 auxiliaires (ILC3), dépendent du facteur de transcription ROR-γt16 et se regroupent en groupes qui sécrètent soit un facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF), IL-17 ou IL-22 en réponse aux signaux locaux IL-1β et IL-2317. Les cellules inductrices du tissu lymphoïde se regroupent dans les patchs de Peyer et sont cruciales pour le développement de ces organes lymphoïdes secondaires au cours du développement18, tandis que les ILC3 sont le sous-type d’ILC le plus abondant dans la lamina propria de l’intestin grêle murin adulte. L’un des premiers systèmes de co-culture organoïde intestinale murine avec des ILC3 a été exploité pour distinguer l’impact de la cytokine IL-22 sur le transducteur de signal et l’activateur de transcription 3 (STAT-3) médié par la répétition riche en leucine contenant le récepteur couplé à la protéine G 5 (Lgr5) + prolifération des cellules souchesintestinales 19, un exemple puissant d’une interaction ILC-épithéliale régénérative. Les ILC présentent une hétérogénéité d’empreinte entre les organes20,21 et présentent une plasticité entre les sous-ensembles en réponse à des cytokines polarisantes22. Ce qui motive ces empreintes tissulaires et ces différences de plasticité, et quel rôle elles jouent dans les maladies chroniques telles que laMII 23, restent des sujets passionnants qui pourraient être abordés à l’aide de co-cultures organoïdes.
Les organoïdes intestinaux sont apparus comme un modèle réussi et fiable pour étudier l’épithélium intestinal24,25. Ceux-ci sont générés par la culture de cellules souches Lgr5+ épithéliales intestinales, ou de cryptes isolées entières, qui incluent des cellules Paneth comme source endogène de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Ces structures 3D sont maintenues soit dans des hydrogels synthétiques26, soit dans des biomatériaux qui imitent la lamina propria basale, par exemple, la matrice extracellulaire basale à réticulation thermique (TBEM), et sont complétées par des facteurs de croissance qui imitent la niche environnante, notamment le facteur de croissance épithélial (EGF), l’inhibiteur de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) Noggin, et un ligand Lgr5 et un agoniste Wnt R-Spondin127 . Dans ces conditions, les organoïdes maintiennent la polarité apico-basale épithéliale et récapitulent la structure crypte-villosité de l’épithélium intestinal avec des cryptes de cellules souches bourgeonnantes qui se différencient en phase terminale en cellules absorbantes et sécrétoires au centre de l’organoïde, qui se déversent ensuite dans le pseudollumen interne par anoikis28. Bien que les organoïdes intestinaux seuls aient été extrêmement avantageux en tant que modèles réductionnistes du développement épithélial et de la dynamique isolément29,30, ils recèlent un énorme potentiel futur pour comprendre comment ces comportements sont régulés, influencés ou même perturbés par le compartiment immunitaire.
Dans le protocole suivant, une méthode de co-culture entre des organoïdes murins de l’intestin grêle et des ILC1 dérivés de la lamina propria est décrite, qui a récemment été utilisée pour identifier comment cette population diminue de manière inattendue les signatures intestinales de l’inflammation et contribue plutôt à une prolifération épithéliale accrue via le TGF-β dans ce système8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit les méthodes permettant d’établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, d’isoler des ILC1 rares en minimisant la perte de lymphocytes pendant le protocole de dissociation intestinale et d’établir des co-cultures entre ces deux compartiments. Ce protocole comporte de nombreuses étapes, et bien que certaines soient spécifiques aux ILC1, cette approche peut être appliquée à d’autres types de cellules immunitaires intestinales, et les configurations de co-culture peuvent être ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R. reconnaît une bourse de doctorat du Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconnaît une bourse de doctorat du Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconnaît une bourse de doctorat du NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconnaît une bourse Marie Skłodowska-Curie, une bourse du Prix du Roi, une bourse rcuk/UKRI Rutherford Fund (MR/R024812/1) et un Seed Award in Science du Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Nous remercions également l’équipe de base de cytométrie en flux BRC basée à l’hôpital Guy. Les souris reporter Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 ont été un don généreux de G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, France). Les souris CD45.1 C57BL/6 ont été aimablement administrées par T. Lawrence (King’s College London, Londres) et P. Barral (King’s College London, Londres).
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
References
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