Summary

Samodling av murina tunntarmsepitelorganoider med medfödda lymfoida celler

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Detta protokoll erbjuder detaljerade instruktioner för att upprätta murina tunntarmsorganoider, isolera typ 1 medfödda lymfoida celler från den murina tunntarmen lamina propria och etablera 3-dimensionella (3D) samkulturer mellan båda celltyperna för att studera dubbelriktade interaktioner mellan tarmepitelceller och typ 1 medfödda lymfoida celler.

Abstract

Komplexa samkulturer av organoider med immunceller ger ett mångsidigt verktyg för att förhöra de dubbelriktade interaktionerna som ligger till grund för den känsliga balansen mellan slemhinnehomeostas. Dessa 3D, multicellulära system erbjuder en reduktionistisk modell för att ta itu med multifaktoriella sjukdomar och lösa tekniska svårigheter som uppstår när man studerar sällsynta celltyper som vävnadsboende medfödda lymfoida celler (ILC). Denna artikel beskriver ett murint system som kombinerar tunntarmsorganoider och tunntarm lamina propria härledda hjälparliknande typ-1 ILC (ILC1s), som lätt kan utvidgas till andra ILC- eller immunpopulationer. ILC är en vävnadsbosatt befolkning som är särskilt berikad i slemhinnan, där de främjar homeostas och snabbt svarar på skador eller infektioner. Organoida samkulturer med ILC har redan börjat belysa nya epitel-immuna signalmoduler i tarmen, vilket avslöjar hur olika ILC-delmängder påverkar tarmepitelbarriärens integritet och regenerering. Detta protokoll kommer att möjliggöra ytterligare undersökningar av ömsesidiga interaktioner mellan epitel- och immunceller, som har potential att ge nya insikter i mekanismerna för slemhinnehomeostas och inflammation.

Introduction

Kommunikation mellan tarmepitelet och tarmens immunsystem är centralt för upprätthållandet av intestinal homeostas1. Störningar i dessa interaktioner är förknippade med både lokala och systemiska sjukdomar, inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och gastrointestinal cancer2. Ett anmärkningsvärt exempel på en mer nyligen beskriven kritisk regulator av homeostas kommer från studien av medfödda lymfoida celler (ILC), som har framträtt som nyckelaktörer i tarmimmunlandskapet3. ILC är en grupp heterogena medfödda immunceller som reglerar intestinal homeostas och orkestrerar inflammation till stor del genom cytokinmedierad signalering4.

Murin ILC är i stort sett indelade i subtyper baserade på transkriptionsfaktor-, receptor- och cytokinuttrycksprofiler5. Typ 1 ILC, som inkluderar cytotoxiska Natural Killer (NK) -celler och hjälparliknande typ 1 ILC (ILC1s), definieras genom uttryck av transkriptionsfaktorn (eomesodermin) Eomes och T-boxprotein uttryckt i T-celler (T-bet)6, respektive utsöndrar cytokiner associerade med T-hjälpare typ-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) och tumörnekrosfaktor (TNF), som svar på interleukin (IL)-12, IL-15 och IL-187. Under homeostas utsöndrar vävnadsinvånade ILC1:er Transforming Growth Factor β (TGF-β) för att driva epitelproliferation och matrisremodellering8. Typ 2 ILC(2) svarar främst på helminthinfektion via utsöndring av T-hjälpare typ-2 (TH2) associerade cytokiner: IL-4, IL-5 och IL-13, och kännetecknas av uttrycket av retinsyrarelaterad orphan receptor (ROR) α (ROR-α)9 och GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos möss kännetecknas intestinala “inflammatoriska” ILC2s vidare av uttryck av Killer cell lectin-liknande receptor (underfamilj G-medlem 1, KLRG)13 där de svarar på epitelial tuft-cell härledd IL-2514,15. Slutligen är typ 3 ILC, som inkluderar lymfoida vävnadsinducerarceller och hjälparliknande typ-3 ILC (ILC3s), beroende av transkriptionsfaktorn ROR-γt16 och kluster i grupper som utsöndrar antingen granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som svar på lokala IL-1β- och IL-23-signaler17. Lymfoida vävnadsinduceringsceller kluster i Peyers plåster och är avgörande för utvecklingen av dessa sekundära lymfoida organ under utveckling18, medan ILC3 är den vanligaste ILC-subtypen i den vuxna murina tunntarmen lamina propria. Ett av de tidigaste murina intestinala organoida samodlingssystemen med ILC3 utnyttjades för att reta isär effekten av cytokinet IL-22 på signalgivare och aktivator av transkription 3 (STAT-3) medierad leucinrik upprepning innehållande G-protein kopplad receptor 5 (Lgr5) + intestinal stamcellsproliferation19, ett kraftfullt exempel på en regenerativ ILC-epitelinteraktion. ILC uppvisar imprint-heterogenitet mellan organ 20,21 och uppvisar plasticitet mellan delmängder som svar på polariserande cytokiner22. Vad som driver dessa vävnadsspecifika avtryck och plasticitetsskillnader, och vilken roll de spelar i kroniska sjukdomar som IBD23, är fortfarande spännande ämnen som kan hanteras med hjälp av organoida samkulturer.

Tarmorganoider har framträtt som en framgångsrik och pålitlig modell för att studera tarmepitelet24,25. Dessa genereras genom odling av intestinala epiteliala Lgr5 + stamceller, eller hela isolerade krypter, som inkluderar Paneth-celler som en endogen källa till Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Dessa 3D-strukturer upprätthålls antingen i syntetiska hydrogeler26 eller i biomaterial som efterliknar den basala lamina propria, till exempel Termisk tvärbindning Basal Extracellular Matrix (TBEM), och kompletteras ytterligare med tillväxtfaktorer som efterliknar den omgivande nischen, framför allt Epitelial Growth Factor (EGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP)-hämmaren Noggin och en Lgr5-ligand och Wnt-agonist R-Spondin127 . Under dessa förhållanden upprätthåller organoider epitelial apico-basal polaritet och rekapitulerar krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirande stamcellskrypter som terminalt differentieras till absorberande och sekretoriska celler i mitten av organoiden, som sedan kasta in i den inre pseudolumen med anoikis28. Även om tarmorganoider ensamma har varit enormt fördelaktiga som reduktionistiska modeller av epitelutveckling och dynamik isolerat 29,30, har de en enorm framtida potential för att förstå hur dessa beteenden regleras, påverkas eller till och med störs av immunfacket.

I följande protokoll beskrivs en metod för samodling mellan murina tunntarmsorganoider och lamina propria härledda ILC1s, som nyligen användes för att identifiera hur denna population oväntat minskar tarmsignaturerna av inflammation och istället bidrar till ökad epitelproliferation via TGF-β i detta system8.

Protocol

Alla försök måste slutföras i enlighet med och i enlighet med alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer för djuranvändning. Etiskt godkännande för studien som beskrivs i följande artikel och video har förvärvats i enlighet med och i enlighet med alla relevanta regulatoriska och institutionella riktlinjer för djuranvändning. Alla möss avlivades genom cervikal förskjutning enligt det etiska standardförfarandet, utfört av utbildade individer. Före organ- och vävn…

Representative Results

När de är framgångsrikt färdiga bör nyisolerade krypter bilda spirande kryptstrukturer inom 2-4 dagar (figur 1A). Friska och robusta organoidkulturer bör växa aktivt och kan passeras och utvidgas enligt vad som beskrivs i protokollet. Detta protokoll beskriver isoleringen av tunntarmen ILC1 från RORγtGFP murin transgen reporterlinje, vilket möjliggör isolering av levande ILC1 av FACS (Figur 2). Med hjälp av prot…

Discussion

Detta protokoll beskriver metoderna för att etablera murina tunntarmsorganoider, isolera sällsynta ILC1 genom att minimera förlusten av lymfocyter under tarmdissociationsprotokollet och etablera samkulturer mellan dessa två fack. Det finns många steg i detta protokoll, och medan vissa är specifika för ILC1, kan detta tillvägagångssätt tillämpas på andra intestinala immuncellstyper, och samodlingsinställningar kan anpassas modulärt för att passa enskilda forskningsfrågor. Flera kritiska steg (som rekommend…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.R. erkänner ett Ph.D. stipendium från Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. erkänner ett Ph.D. stipendium från Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). DC erkänner en doktorsexamen från NIHR GSTT BRC. J.F.N. erkänner ett Marie Skłodowska-Curie Fellowship, ett King’s Prize-stipendium, ett RCUK/UKRI Rutherford Fund-stipendium (MR/R024812/1) och ett Seed Award in Science från Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi tackar också BRC-flödescytometrikärnteamet baserat på Guy’s Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermöss var en generös gåva från G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrike). CD45.1 C57BL/6 möss gavs vänligt av T. Lawrence (King’s College London, London) och P. Barral (King’s College London, London).

Materials

Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. 발생학. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).
check_url/kr/63554?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

View Video