Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir Candida albicans
Summary
La creciente incidencia de Candida albicans resistente a los medicamentos es un grave problema de salud en todo el mundo. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer una estrategia para luchar contra las infecciones fúngicas resistentes a los medicamentos. El presente protocolo describe la eficacia de la aPDT mediada por Rose bengal en una cepa de C. albicans multirresistente in vitro.
Abstract
La infección invasiva por Candida albicans es una infección fúngica oportunista significativa en humanos porque es uno de los colonizadores más comunes del intestino, la boca, la vagina y la piel. A pesar de la disponibilidad de medicamentos antimicóticos, la tasa de mortalidad de la candidiasis invasiva sigue siendo de ~ 50%. Desafortunadamente, la incidencia de C. albicans resistente a los medicamentos está aumentando a nivel mundial. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer un tratamiento alternativo o adyuvante para inhibir la formación de biopelículas de C. albicans y superar la resistencia a los medicamentos. La aPDT mediada por rosa de bengala (RB) ha demostrado una eliminación celular efectiva de bacterias y C. albicans. En este estudio, se describe la eficacia de RB-aPDT en C. albicans multirresistente . Una fuente de luz de diodo emisor de luz verde (LED) casera está diseñada para alinearse con el centro de un pozo de una placa de 96 pocillos. Las levaduras se incubaron en los pozos con diferentes concentraciones de RB y se iluminaron con diferentes fluencias de luz verde. Los efectos de matanza se analizaron mediante el método de dilución de placas. Con una combinación óptima de luz y RB, se logró la inhibición del crecimiento de 3 log. Se concluyó que RB-aPDT podría inhibir potencialmente la C. albicans resistente a los medicamentos.
Introduction
C. albicans coloniza en los tractos gastrointestinal y genitourinario de individuos sanos y puede detectarse como microbiota normal en aproximadamente el 50 por ciento de los individuos1. Si se crea un desequilibrio entre el huésped y el patógeno, C. albicans es capaz de invadir y causar enfermedades. La infección puede variar desde infecciones locales de la membrana mucosa hasta insuficiencia orgánica múltiple2. En un estudio de vigilancia multicéntrico en los Estados Unidos, alrededor de la mitad de los aislamientos de pacientes con candidiasis invasiva entre 2009 y 2017 es C. albicans3. La candidemia puede asociarse con altas tasas de morbilidad, mortalidad, estancia hospitalaria prolongada4. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos informaron que aproximadamente el 7% de todas las muestras de sangre de Candida analizadas son resistentes al medicamento antimicótico fluconazol5. La aparición de especies de Candida resistentes a los medicamentos plantea la preocupación de desarrollar una terapia alternativa o adyuvante a los agentes antimicóticos.
La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) consiste en activar un fotosensibilizador (PS) específico con luz en la longitud de onda de absorción máxima de la PS6. Después de la excitación, el PS excitado transfiere su energía o electrones a las moléculas de oxígeno cercanas y regresa al estado fundamental. Durante este proceso, se forman especies reactivas de oxígeno y oxígeno singlete y causan daño celular. La aPDT se ha utilizado ampliamente para matar microorganismos desde la década de 19907. Uno de los beneficios de la aPDT es que múltiples orgánulos se dañan en una célula por oxígeno singlete y / o especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la irradiación; por lo tanto, la resistencia a la APDT no se ha encontrado hasta hoy. Además, un estudio reciente informó que las bacterias que sobrevivieron después de la aPDT se volvieron más sensibles a los antibióticos8.
Las fuentes de luz utilizadas en aPDT incluyen láseres, lámparas halógenas de metal con filtros, luz infrarroja cercana y diodo emisor de luz (LED)9,10,11,12. El láser proporciona una alta potencia de luz, generalmente mayor que 0,5 W / cm2, que permite la entrega de una dosis de luz alta en muy poco tiempo. Se ha utilizado ampliamente en los casos en que un tiempo de tratamiento más largo es inconveniente, como la APDT para las infecciones orales. El inconveniente de un láser es que su tamaño de punto de iluminación es pequeño, que va desde unos pocos cientos de micrómetros hasta 10 mm con un difusor. Además, los equipos láser son caros y necesitan capacitación específica para operar. Por otro lado, el área de irradiación de una lámpara halógena de metal con filtros es relativamente más grande13. Sin embargo, la lámpara es demasiado pesada y cara. Las fuentes de luz LED se han convertido en la corriente principal de aPDT en el campo dermatológico porque es pequeña y menos costosa. El área de irradiación puede ser relativamente grande con una disposición de matriz de la bombilla LED. Toda la cara se puede iluminar al mismo tiempo9. Sin embargo, la mayoría, si no todas, las fuentes de luz LED disponibles hoy en día están diseñadas para uso clínico. Puede que no sea adecuado para experimentos en un laboratorio porque ocupa espacio y es costoso. Desarrollamos una matriz de LED económica que es muy pequeña y se puede cortar y ensamblar a partir de una tira de LED. Los LED se pueden instalar en diferentes arreglos para diferentes diseños experimentales. Se pueden completar diferentes condiciones de aPDT en una placa de 96 pocillos o incluso una placa de 384 pocillos en un experimento.
Rose bengal (RB) es un tinte de color ampliamente utilizado para mejorar la visualización de los daños corneales en los ojos humanos14. La aPDT mediada por RB ha demostrado efectos asesinos sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli y C. albicans con una eficiencia aproximadamente comparable a la del azul de toluidina O15. Este estudio demuestra un método para validar el efecto de RB-aPDT sobre C. albicans multirresistente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recientemente se han reportado resultados alentadores de aplicaciones clínicas de RB-PDT para la queratitis fúngica19. El pico de absorción de RB está en 450-650 nm. Es esencial determinar la tasa de fluencia de la fuente de luz para una aPDT exitosa. Se requiere una fluencia alta (generalmente >100 J/cm2) para tratar las células cancerosas, mientras que se espera una fluencia más baja para tratar las lesiones infectadas6. Una alta fluencia significa un lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha recibido financiación del Centro de Nanomedicina Aplicada, Universidad Nacional Cheng Kung del Programa del Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Sprout de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE), y del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán [MOST 109-2327-B-006-005] a TW Wong. J.H. Hung reconoce la financiación del Hospital Universitario Nacional Cheng Kung, Taiwán [NCKUH-11006018] y [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
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