स्तनधारी सेल लाइसेट्स में ई 3 यूबिक्विटिन-लिगेज द्वारा सब्सट्रेट सर्वव्यापीता का मूल्यांकन
Summary
हम स्तनधारी कोशिकाओं में एक विशिष्ट सब्सट्रेट और एक ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज के सर्वव्यापी परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एचईके 293 टी सेल लाइनों का उपयोग प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन के लिए किया गया था, पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड सब्सट्रेट को इम्यूनोप्रेसिपिटेशन द्वारा सेल लाइसेट्स से शुद्ध किया गया था, और एसडीएस-पेज में हल किया गया था। इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग इस पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की कल्पना करने के लिए किया गया था।
Abstract
सर्वव्यापीता एक पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो यूकेरियोटिक कोशिकाओं में होता है जो कोशिका अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव सहित कई जैविक मार्गों के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है जिसमें कम से कम तीन अलग-अलग एंजाइमों की कैस्केड प्रतिक्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट के लिए यूबिक्विटिन का एक सहसंयोजक लगाव होता है, जो ई 1 (यूबिक्विटिन-सक्रियण एंजाइम), ई 2 (यूबिक्विटिन-संयुग्मित एंजाइम), और ई 3 (यूबिक्विटिन-लिगेज एंजाइम) से बना होता है। ई 3 कॉम्प्लेक्स सब्सट्रेट मान्यता और सर्वव्यापीता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन स्तनधारी कोशिकाओं में सब्सट्रेट सर्वव्यापीता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, जिसमें चयनित सब्सट्रेट, एक ई 3 सर्वव्यापी लिगेज और एक टैग किए गए यूबिक्विटिन को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के क्षणिक सह-अभिकर्मक का उपयोग किया गया है। लाइसिस से पहले, सब्सट्रेट प्रोटियासोमल गिरावट से बचने के लिए ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को प्रोटियासोम अवरोधक एमजी 132 (कार्बोबेंजॉक्सी-ल्यू-ल्यूसिनल) के साथ इलाज किया जाता है। इसके अलावा, सेल निकालने को छोटे पैमाने पर इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (आईपी) को प्रस्तुत किया जाता है ताकि यूबिक्विटिन टैग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता (डब्ल्यूबी) द्वारा बाद में पता लगाने के लिए पॉलीयूबिक्युइटिलेटेड सब्सट्रेट को शुद्ध किया जा सके। इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी परख के लिए एक सुसंगत और सरल प्रोटोकॉल विशिष्ट सब्सट्रेट और ई 3 सर्वव्यापी लिगेज के सर्वव्यापीता को संबोधित करने में वैज्ञानिकों की सहायता करने के लिए वर्णित है।
Introduction
पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) प्रोटीन विनियमन के बारे में एक महत्वपूर्ण तंत्र है, जो सेल होमियोस्टेसिस के लिए आवश्यक है। प्रोटीन सर्वव्यापीता एक गतिशील और जटिल संशोधन है जो विभिन्न संकेतों का वर्गीकरण बनाता है जिसके परिणामस्वरूप यूकेरियोटिक जीवों में कई सेलुलर परिणाम होते हैं। सर्वव्यापीता एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है जिसमें सब्सट्रेट में 76 अमीनो एसिड युक्त एक सर्वव्यापी प्रोटीन का लगाव होता है, जो तीन अलग-अलग प्रतिक्रियाओं द्वारा रचित एंजाइमी कैस्केड में होता है1. पहला चरण यूबिक्विटिन सक्रियण की विशेषता है, जो यूबिक्विटिन सी-टर्मिनस और ई 1 एंजाइम की सक्रिय साइट में मौजूद सिस्टीन अवशेषों के बीच एक उच्च ऊर्जा थायोस्टर-लिंक्ड यूबिक्विटिन बनाने के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस पर निर्भर करता है। इसके बाद, यूबिक्विटिन को ई 2 एंजाइम में स्थानांतरित कर दिया जाता है जो यूबिक्विटिन के साथ एक थायोस्टर-पसंद वाले परिसर का निर्माण करता है। बाद में, सर्वव्यापी ई 2 द्वारा सब्सट्रेट से सहसंयोजक रूप से जुड़ा हुआ है, या अधिक बार, ई 3 एंजाइम द्वारा, जो सब्सट्रेट 2,3 के साथ पहचानता है और बातचीत करता है। कभी-कभी, मल्टीयूबिक्विटिन श्रृंखला असेंबली को बढ़ावा देने के लिए ई 4 एंजाइम (यूबिक्विटिन-चेन बढ़ाव कारक) आवश्यकहैं 3.
यूबिक्विटिन में सात लाइसिन अवशेष (के 6, के 11, के 27, के 2 9, के 33, के 48 और के 63) हैं, जो पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखलाओं के गठन की अनुमति देते हैं जो विभिन्न त्रिआयामी संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए अलग-अलग लिंकेज उत्पन्न करते हैं जिन्हें कई प्रभावकारी प्रोटीन 4,5 द्वारा पहचाना जा रहा है। इसलिए, सब्सट्रेट में पेश की गई पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला का प्रकार इसके सेल भाग्य 6,7,8 को तय करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, सब्सट्रेट को एन-डीग्रोन नामक एन-टर्मिनल अवशेषों के माध्यम से भी सर्वव्यापी किया जा सकता है। विशिष्ट ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज एन-डिग्रॉन मान्यता के लिए जिम्मेदार हैं, जिससे पास के लाइसिन अवशेषों के पॉलीयूबिक्विटाइलेशन की अनुमति मिलती है9.
आजकल, 40 से अधिक विभिन्न एससीएफ-विशिष्ट सब्सट्रेट की विशेषता है। उनमें से, कोशिका भेदभाव और विकास के साथ-साथ कोशिका अस्तित्व और मृत्यु सहित कई जैविक मार्गों के प्रमुखनियामक10,11,12,13 पाए जा सकते हैं। इस प्रकार, विभिन्न जैविक घटनाओं का एक व्यापक नक्शा तैयार करने के लिए प्रत्येक ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज के विशिष्ट सब्सट्रेट की पहचान आवश्यक है। भले ही सच्चे सब्सट्रेट की पहचान जैव रासायनिक रूप से चुनौतीपूर्ण है, जैव रसायन-आधारित विधियों का उपयोग श्रृंखला विशिष्टता और मोनो- और पॉलीयूबिक्विटाइलेशन14 के बीच अंतर का मूल्यांकन करने के लिए बहुत उपयुक्त है। यह अध्ययन स्तनधारी सेल लाइन एचईके 293 टी का उपयोग करके सर्वव्यापी परख के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो सब्सट्रेट यूएक्सटी-वी 2 (सर्वव्यापी रूप से व्यक्त प्रीफोल्डिन-जैसे चैपरोन आइसोफॉर्म 2) को ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज कॉम्प्लेक्स एससीएफ (एफबीएक्सओ 7) के साथ अतिरंजित करता है। यूएक्सटी-वी 2 एनएफ-κबी सिग्नलिंग के लिए एक आवश्यक सह-कारक है, और एक बार जब यह प्रोटीन कोशिकाओं में खटखटाया जाता है, तो यह टीएनएफ-α-प्रेरित एनएफ-οबी सक्रियण11 को रोकता है। इस प्रकार, पॉलीयूबिक्यूटाइलेटेड यूएक्सटी-वी 2 का पता लगाने के लिए, प्रोटियासोम अवरोधक एमजी 132 का उपयोग किया जाता है क्योंकि इसमें प्रोटियासोम कॉम्प्लेक्स15 के 26 एस सबयूनिट की प्रोटियोलिटिक गतिविधि को अवरुद्ध करने की क्षमता होती है। इसके अलावा, सेल निकालने को सब्सट्रेट को शुद्ध करने के लिए एक छोटे पैमाने पर आईपी में प्रस्तुत किया जाता है, चयनित एंटीबॉडी का उपयोग करके डब्ल्यूबी द्वारा बाद में पता लगाने के लिए एगरोज़ राल के लिए स्थिर एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल सेलुलर वातावरण में सब्सट्रेट सर्वव्यापीता को मान्य करने के लिए बहुत उपयोगी है, और इसे विभिन्न प्रकार के स्तनधारी कोशिकाओं और अन्य ई 3 सर्वव्यापी-लिगेज परिसरों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, इन विट्रो सर्वव्यापी परख के माध्यम से परीक्षण किए गए सब्सट्रेट को मान्य करना आवश्यक है, क्योंकि दोनों प्रोटोकॉल सच्चे सब्सट्रेट की पहचान के बारे में एक दूसरे के पूरक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सर्वव्यापीता एक आवश्यक पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो कई प्रोटीनों के स्तर को नियंत्रित करता है और कई सिग्नलिंग मार्गों और जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, एक स्वस्थ इंट्रासेल्यु…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एफ.आर.टी. एफएपीईएसपी अनुदान संख्या 2020/15771-6 और सीएनपीक्यू यूनिवर्सल 405836/2018-0 द्वारा समर्थित है। पीएमएसपी और वीएस सीएपीएस द्वारा समर्थित हैं। सी.आर.एस.टी.बी.सी. को एफएपीईएसपी छात्रवृत्ति संख्या 2019/23466-1 द्वारा समर्थित किया गया था। हम सामग्री समर्थन के लिए सैंड्रा आरसी मारुयामा (एफएपीईएसपी 2016/20258-0) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
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