Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero
Summary
Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un’ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L’immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.
Abstract
L’ubiquitilazione è una modifica post-traduzionale che si verifica nelle cellule eucariotiche che è fondamentale per la regolazione di diversi percorsi biologici, tra cui la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la differenziazione. È un processo reversibile che consiste in un attaccamento covalente di ubiquitina al substrato attraverso una reazione a cascata di almeno tre diversi enzimi, composti da E1 (enzima di attivazione dell’ubiquitina), E2 (enzima coniugante dell’ubiquitina) ed E3 (enzima Ubiquitina-ligasi). Il complesso E3 svolge un ruolo importante nel riconoscimento del substrato e nell’ubiquitilazione. Qui, viene descritto un protocollo per valutare l’ubiquitilazione del substrato nelle cellule di mammifero utilizzando la co-trasfezione transitoria di un plasmide che codifica il substrato selezionato, una ubiquitina ligasi E3 e un’ubiquitina marcata. Prima della lisi, le cellule trasfettate vengono trattate con l’inibitore del proteasoma MG132 (carbobenzossi-leu-leu-leucinale) per evitare la degradazione proteasomiale del substrato. Inoltre, l’estratto cellulare viene sottoposto a immunoprecipitazione su piccola scala (IP) per purificare il substrato poliubiquitilato per la successiva rilevazione mediante western blotting (WB) utilizzando anticorpi specifici per il tag ubiquitina. Quindi, viene descritto un protocollo coerente e semplice per il test di ubiquitilazione nelle cellule di mammifero per aiutare gli scienziati ad affrontare l’ubiquitilazione di substrati specifici e le ligasi di ubiquitina E3.
Introduction
Le modificazioni post-traduzionali (PTM) sono un meccanismo importante per quanto riguarda la regolazione delle proteine, che è essenziale per l’omeostasi cellulare. L’ubiquitilazione proteica è una modifica dinamica e intricata che crea un assortimento di segnali diversi con conseguenti diversi risultati cellulari negli organismi eucariotici. L’ubiquitilazione è un processo reversibile che consiste nell’attaccamento di una proteina di ubiquitina contenente 76 amminoacidi al substrato, che si verifica in una cascata enzimatica composta da tre reazioni distinte1. Il primo passo è caratterizzato dall’attivazione dell’ubiquitina, che dipende da un’idrolisi dell’ATP per formare un’ubiquitina legata al tioestere ad alta energia tra l’ubiquitina C-terminus e il residuo di cisteina presente nel sito attivo dell’enzima E1. Successivamente, l’ubiquitina viene trasferita all’enzima E2 formando un complesso simile al tioestere con l’ubiquitina. Successivamente, l’ubiquitina viene attaccata covalentemente al substrato dall’E2, o più spesso, dall’enzima E3, che riconosce e interagisce con il substrato 2,3. Occasionalmente, gli enzimi E4 (fattori di allungamento della catena dell’ubiquitina) sono necessari per promuovere l’assemblaggio della catena multiubiquitina3.
L’ubiquitina ha sette residui di lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63), consentendo la formazione di catene di poliubiquitina che generano legami distinti per produrre diverse strutture tridimensionali che saranno riconosciute da diverse proteine effettrici 4,5. Quindi, il tipo di catena di poliubiquitina introdotta nel substrato è essenziale per decidere il suo destino cellulare 6,7,8. Inoltre, il substrato potrebbe anche essere ubiquitinato attraverso i suoi residui N-terminali chiamati N-degrons. Specifiche ubiquitina-ligasi E3 sono responsabili del riconoscimento dell’N-degron, consentendo la poliubiquitilazione del vicino residuo di lisina9.
Al giorno d’oggi, ci sono più di 40 diversi substrati specifici SCF caratterizzati. Tra questi, i regolatori chiave di diversi percorsi biologici, tra cui la differenziazione e lo sviluppo cellulare, nonché la sopravvivenza e la morte cellulare, possono essere trovati 10,11,12,13. Pertanto, l’identificazione di substrati specifici di ciascuna ubiquitina-ligasi E3 è essenziale per progettare una mappa completa di vari eventi biologici. Anche se l’identificazione di veri substrati è biochimicamente impegnativa, l’uso di metodi basati sulla biochimica è molto adatto per valutare la specificità della catena e la distinzione tra mono- e poliubiquitilazione14. Questo studio descrive un protocollo completo per il test di ubiquitilazione utilizzando la linea cellulare di mammiferi HEK293T sovraesprimendo il substrato UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) con il complesso E3 ubiquitina-ligasi SCF (Fbxo7). UXT-V2 è un co-fattore essenziale per la segnalazione di NF-κB e, una volta che questa proteina viene abbattuta nelle cellule, inibisce l’attivazione NF-κB indotta da TNF-α11. Pertanto, per rilevare UXT-V2 poliubiquitilato, viene utilizzato l’inibitore del proteasoma MG132 poiché ha la capacità di bloccare l’attività proteolitica della subunità 26S del complesso proteasoma15. Inoltre, l’estratto cellulare viene sottoposto a un IP su piccola scala per purificare il substrato, utilizzando un anticorpo specifico immobilizzato alla resina di agarosio per la successiva rilevazione da parte di WB utilizzando anticorpi selezionati. Questo protocollo è molto utile per convalidare l’ubiquitilazione del substrato nell’ambiente cellulare e può anche essere adattato per diversi tipi di cellule di mammifero e altri complessi E3 ubiquitina-ligasi. Tuttavia, è necessario convalidare il substrato testato anche attraverso un test di ubiquitilazione in vitro, poiché entrambi i protocolli si completano a vicenda per quanto riguarda l’identificazione di substrati reali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ubiquitilazione è una modificazione post-traduzionale essenziale che regola i livelli di diverse proteine e svolge un ruolo cruciale in molte vie di segnalazione e processi biologici, garantendo un ambiente intracellulare sano. Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è uno dei principali focus della recente ricerca farmaceutica, fornendo la possibilità di stabilizzare i soppressori tumorali o indurre la degradazione dei prodotti oncogeni22. Ad esempio, la proliferazione aberrante delle neoplas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T è supportato dal numero di sovvenzione FAPESP 2020/15771-6 e CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P e V.S sono supportati da CAPES. C.R.S.T.B.C è stato supportato dalla borsa di studio FAPESP numero 2019/23466-1. Ringraziamo Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) per il supporto materiale.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
References
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