올레산 유도 급성 호흡곤란 증후군의 마우스 모델
Summary
본 프로토콜은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 모방하기 위해 올레산을 사용하는 마우스의 폐 손상 모델을 설명합니다. 이 모델은 부종에 대한 염증 매개체를 증가시키고 폐 순응도를 감소시킵니다. 올레산은 소금 형태(올레산염)로 사용되는데, 이 생리학적 형태가 색전증의 위험을 피하기 때문입니다.
Abstract
급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 치사율이 높은 중환자에게 심각한 위협이 됩니다. 오염 물질 노출, 담배 연기, 감염원, 지방산 등이 ARDS를 유발할 수 있습니다. 동물 모델은 ARDS의 복잡한 병리기전을 모방할 수 있습니다. 그러나 각각에는 한계가 있습니다. 특히 올레산(OA)은 중증 환자에서 증가하여 폐에 해로운 영향을 미칩니다. 골관절염은 색전, 조직 파괴, pH 변화, 부종 제거 손상 등을 통해 폐 손상을 유발할 수 있습니다. OA 유발 폐 손상 모델은 내피 손상, 폐포 투과성 증가, 염증, 막 유리질 형성 및 세포 사멸을 동반한 ARDS의 다양한 특징과 유사합니다. 본원에서, 폐 손상의 유도는 pH 7에서 OA의 생리학적 형태이기 때문에 OA(염 형태)를 폐에 직접 주입하고 마우스에 정맥 주사함으로써 설명된다. 따라서 소금 형태의 OA 주입은 색전을 유발하거나 pH를 변경하지 않고 폐 손상/ARDS를 연구하는 데 유용한 동물 모델이며, 이를 통해 중증 환자에서 일어나는 일에 근접할 수 있습니다.
Introduction
Ashbaugh et al.1은 1967년에 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)을 처음 기술했으며 그 이후로 여러 차례 개정되었습니다. 베를린의 정의에 따르면, ARDS는 환기 대 관류 비율의 불균형, 미만성 양측 폐포 손상(DAD) 및 침윤, 폐 무게 증가, 부종 2,3으로 인해 급성 호흡 부전 및 저산소혈증(PaO2/FiO2 > 300mmHg)을 유발하는 폐 염증입니다. 폐 실질은 상피, 내피 및 기타 세포가 복합된 복잡한 세포 환경입니다. 이 세포들은 허파꽈리에서 가스 교환과 항상성을 담당하는 장벽과 구조를 형성한다3. 상피 장벽 내에서 가장 풍부한 세포는 Na/K-ATPase를 통한 가스 교환 및 체액 관리를 위한 더 큰 표면적을 가진 폐포 유형 I 세포(AT1)입니다. 또한, 폐포 II형 세포(AT2)는 계면활성제를 생산하여 허파꽈리의 표면장력을 감소시킨다4. 그 아래에는 내피 세포가 반투과성 장벽을 형성하여 폐 순환과 간질을 분리합니다. 그 기능에는 자극 감지, 염증 반응 조정, 세포 이동이 포함됩니다5. 내피세포는 또한 가스 교환, 혈관 긴장도, 응고를 조절한다5. 따라서 내피 및 상피 기능 장애는 전염증성 표현형을 악화시켜 폐 손상을 일으켜 ARDS를 유발할 수있다 5.
ARDS의 발병은 세균성 및 바이러스성 폐렴 또는 비폐패혈증, 외상, 수혈, 췌장염과 같은 간접적인 요인과 관련이 있다6. 이러한 조건은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 및 손상 관련 분자 패턴(DAMP)의 방출을 유발하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8과 같은 전염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도합니다5. TNF-α는 내피 장벽 파괴 및 폐 실질로의 백혈구 침윤에서 혈관-내피 카데린(VE-cadherin) 분해와 관련이 있습니다. 호중구는 IL-8 및 LTB4 5,7,8에 의해 유도되어 이동하는 첫 번째 세포입니다. 호중구는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine), 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)9 및 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap, NET) 형성을 증가시켜 추가적인 내피 및 상피 손상을 발생시킨다10. 상피 손상은 AT2 세포와 상주 대식세포에서 염증과 톨 유사 수용체의 활성화를 촉진하여 염증 세포를 폐로 끌어들이는 케모카인의 방출을 유도한다4. 또한 인터페론-β(INFβ)과 같은 사이토카인의 생성은 TNF 관련 세포사멸 유도 수용체(TRAIL)를 유발하여 ATII 세포를 세포사멸로 유도하여 체액 및 이온 클라렌스를 손상시킵니다4. 내피 및 상피 장벽 구조의 파괴로 인해 체액, 단백질, 적혈구 및 백혈구가 폐포 공간으로 유입되어 부종을 유발합니다. 부종이 생기면 호흡과 가스 교환을 유지하려는 폐의 노력이 바뀐다11. 고탄산혈증과 저산소혈증은 세포 사멸과 나트륨 수송 장애를 유발하여 불량한 제거 능력으로 인한 폐포 부종을 악화시킨다10. ARDS는 또한 장기 기능 장애, 폐포 호중구 비율 증가, 폐포 투과성과 관련된 IL-17A 수치 상승을 나타낸다9.
최근 몇 년 동안 ARDS의 병태생리학, 역학 및 치료에 대한 연구가 지속적으로 발전하고 있습니다12,13. 그러나 ARDS는 기계적 환기 및 수액 치료 최적화를 초래하는 치료 연구의 진전에도 불구하고 이질적인 증후군입니다. 따라서 보다 효과적인 직접 약물 치료가 여전히 필요하며10 동물 연구는 ARDS 메커니즘과 중재 대상을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.
현재의 ARDS 모델은 병리학을 완전히 복제할 수 없습니다. 따라서 연구자들은 종종 자신의 관심사에 더 잘 맞을 수 있는 모델을 선택합니다. 예를 들어, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 유도 모델은 주로 TLR4에 의해 유발되는 내독성 쇼크에 의해 ARDS를 유도한다14. HCl 유도는 산 흡인을 모방하며, 손상은 호중구에 의존한다14. 한편, 현재의 올레산나트륨 모델은 혈관 투과성과 부종을 증가시키는 내피 손상을 유발합니다. 또한 액체 형태의 올레산 대신 올레산 나트륨을 사용하면 색전증 위험과 혈액 pH15의 변화를 피할 수 있습니다.
ARDS용 동물 모델
동물 모델을 이용한 전임상 연구는 병리학을 이해하는 데 도움이 되며 새로운 ARDS 치료 연구에 필수적입니다. 이상적인 동물모델은 임상적 상황과 유사한 특성과 각 질병 단계, 진화 및 복구의 관련 병태생리학적 특징과 함께 질병 기전의 우수한 재현성을 가져야 한다14. ARDS의 급성 폐 손상을 전임상적으로 평가하기 위해 여러 동물 모델이 사용됩니다. 그러나 모든 모델에는 한계가 있기 때문에 인간 병리학 6,14,16을 완전히 재현하지는 못한다. 올레산-유도 ARDS는 다른 동물 종에서 사용된다17. 골관절염 주사를 맞은 돼지18, 양19, 개20은 폐포-모세혈관막 기능 장애, 단백질 및 세포 침윤으로 인한 투과성 증가 등 질병의 다양한 임상적 특징을 나타낸다.
예를 들어, 1.25μM의 OA를 정맥 주사하면 경상피 수송이 차단되어 폐포 부종이발생한다 15. 대안적으로, A549 세포를 사용한 시험관 내 모델에서, 10μM 농도의 OA는 상피 나트륨 채널(eNAC) 또는 Na/K-ATPase의 발현을 변화시키지 않았다. 그러나, OA는 두 채널 모두와 연관되어 그들의 활동을 직접적으로 억제하는 것으로 보인다21. 0.1mL/kg의 OA 정맥 주사는 폐 조직의 울혈과 부종을 유발하고, 폐포 중격이 두꺼워지면서 폐포 공간이 줄어들고, 염증성 및 적혈구 수가 증가했다22. 또한, OA는 폐의 내피 및 상피 세포에서 세포 사멸과 괴사를 유도했다15. 생쥐에서 기관내로 트리스-올레이트 용액을 주입하면 자극 후 6시간 이내에 호중구 침윤 및 부종이 증가한다23. 24시간 OA 주사는 전염증성 사이토카인 수치(즉, TNF-α, IL-6 및 IL-1β)를 증가시켰습니다23. 또한 트리스-올레에이트 10μM의 정맥 주사(안와신경총)는 선택적 효소 억제제인 10-3μM의 우아바인과 유사한 폐 Na/K-ATPase 활성을 억제합니다. 또한 OA는 세포 침투, 지질체 형성, 류코트리엔 B4(LTB4) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성으로 염증을 유발합니다.22,24. 따라서 올레산 유도 ARDS는 부종, 출혈, 호중구 침윤, 골수화효소(MPO) 활성 증가 및 ROS24를 생성합니다. 따라서 OA 투여는 폐 손상에 대한 잘 확립된 모델입니다22,25. OA가 있는 이 기사에 제시된 모든 결과는 소금 형태인 올레산나트륨을 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전임상 연구를 수행하기 위해서는 올바른 ARDS 모델을 선택하는 것이 필수적이며, 평가자는 연령, 성별, 투여 방법 등과 같은 가능한 모든 변수를 고려해야 한다6. 선택한 모델은 패혈증, 지질 색전증, 폐혈관 허혈 재관류 및 기타 임상적 위험과 같은 위험 요인에 따라 질병을 재현해야 한다14. 그러나 ARDS에 사용된 동물 모델은 인간 증후군의 모든 특징을 재현할 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)의 지원을 받았습니다. 그리고 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). 그림 1과 그림 2는 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다.
Materials
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
- Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
- The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
- Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
- D’Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
- Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
- Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
- Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 18 (2019).
- Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
- Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), 34 (2013).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
- Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
- Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
- Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
- Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
- Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
- Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
- Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
- Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
- Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
- McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
- Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
- Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
- Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies – Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
- Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
- Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
- Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
- Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
- Yu, M. -. y. a. l., et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).
