オレイン酸誘発性急性呼吸窮迫症候群モデルマウス
Summary
本プロトコルは、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を模倣するためにオレイン酸を使用するマウスの肺損傷モデルについて記述する。このモデルは、浮腫の炎症性メディエーターを増加させ、肺コンプライアンスを低下させます。オレイン酸は、この生理学的形態が塞栓症のリスクを回避するため、塩の形態(オレイン酸)で使用されます。
Abstract
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、致死率の高い重症患者にとって重大な脅威です。汚染物質への曝露、タバコの煙、感染性病原体、および脂肪酸は、ARDSを誘発する可能性があります。動物モデルは、ARDSの複雑な病態メカニズムを模倣することができます。ただし、それぞれに制限があります。特に、オレイン酸(OA)は、肺に有害な影響を与える重症患者で増加します。OAは、塞栓、組織破壊、pHの変化、浮腫クリアランスの障害によって肺損傷を誘発する可能性があります。OA誘発性肺損傷モデルは、内皮損傷、肺胞透過性の増加、炎症、膜硝子形成、および細胞死を伴うARDSのさまざまな特徴に似ています。本明細書では、肺損傷の誘発は、pH 7におけるOAの生理学的形態であるため、OA(塩形態)を肺に直接注射し、マウスに静脈内注射することによって説明される。したがって、塩の形でのOAの注射は、塞栓を引き起こしたりpHを変化させたりすることなく、肺損傷/ARDSを研究するための有用な動物モデルであり、それによって重症患者で起こっていることに近づきます。
Introduction
Ashbaugh et al.1 は、1967 年に急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) について初めて記述し、それ以来、複数回の改訂を経てきました。ベルリンの定義によると、ARDSは急性呼吸不全と低酸素血症(PaO 2 / FiO 2 > 300 mm Hg)につながる肺の炎症です 換気と灌流の比率の不均衡、びまん性両側肺胞損傷(DAD)と浸潤、肺重量の増加、および浮腫2,3。肺実質は、上皮細胞、内皮細胞、およびその他の細胞が複合化した複雑な細胞環境です。これらの細胞は、肺胞3におけるガス交換および恒常性に関与する障壁および構造を形成する。上皮バリア内に最も多く存在する細胞は、Na/K-ATPaseを介したガス交換と体液管理のための表面積が大きい肺胞I型細胞(AT1)です。また、肺胞II型細胞(AT2)は界面活性剤を産生し、肺胞4の表面張力を低下させる。その下では、内皮細胞が肺循環を間質から分離する半透性バリアを形成しています。その機能には、刺激の検出、炎症反応の調整、および細胞転生が含まれます5。また、内皮細胞はガス交換、血管緊張、凝固を調節する5。したがって、内皮および上皮機能障害は炎症性表現型を悪化させ、ARDS5につながる肺の損傷を引き起こす可能性があります。
ARDSの発症は、細菌性肺炎やウイルス性肺炎、または非肺敗血症、外傷、輸血、膵炎などの間接的な要因とリスクが関連しています6。これらの状態は、病原体関連分子パターン(PAMP)および損傷関連分子パターン(DAMP)の放出を引き起こし、TNF-α、IL-1β、IL-6、およびIL-8などの炎症性サイトカインおよびケモカインを誘導します5。TNF-αは、血管内皮カドヘリン(VE-カドヘリン)の内皮バリア破壊および肺実質への白血球浸潤に関連しています。好中球は、IL-8およびLTB4 5,7,8に引き寄せられて移動する最初の細胞です。好中球は、炎症性サイトカイン、活性酸素種(ROS)9、好中球細胞外トラップ(NET)の形成をさらに増加させ、余分な内皮および上皮損傷を引き起こします10。上皮損傷は、AT2細胞および常在マクロファージのToll様受容体の炎症と活性化を促し、炎症細胞を肺に引き付けるケモカインの放出を誘導します4。また、インターフェロンβ(INFβ)などのサイトカインの産生は、TNF関連のアポトーシス誘導受容体(TRAIL)を引き起こし、ATII細胞をアポトーシスに導き、体液とイオンクラレンスを損ないます4。内皮および上皮のバリア構造の破壊により、体液、タンパク質、赤血球、および白血球が肺胞腔に流入し、浮腫を引き起こします。浮腫が確立されると、呼吸とガス交換を維持するための肺の努力が変化します11。高炭酸ガス血症と低酸素血症は、細胞死とナトリウム輸送障害を誘発し、クリアランス能力の低下により肺胞浮腫を悪化させます10。ARDSはまた、臓器機能障害、肺胞好中球の割合の増加、および肺胞透過性に関連するIL-17Aのレベルの上昇も示しています9。
近年、ARDSの病態生理学、疫学、および治療に関する研究が継続的に進歩しています12,13。しかし、ARDSは、人工呼吸器や輸液療法の最適化につながる治療研究の進歩にもかかわらず、不均一な症候群です。したがって、より効果的な直接的な薬理学的治療が依然として必要であり10、動物実験はARDSのメカニズムと介入の標的を明らかにするのに役立つ可能性があります。
現在のARDSモデルは、病理学を完全に再現することはできません。したがって、研究者は自分の興味により適したモデルを選択することがよくあります。例えば、リポ多糖(LPS)誘導モデルは、主にTLR414によって引き起こされる内毒性ショックによってARDSを誘導する。HCl誘導は酸吸引を模倣し、損傷は好中栄養依存的である14。一方、現在のオレイン酸ナトリウムモデルは、血管透過性や浮腫を増加させる内皮損傷を誘発します。さらに、オレイン酸の代わりにオレイン酸ナトリウムを液体の形で使用することで、塞栓症のリスクや血液pH15の変化を回避できます。
ARDSの動物モデル
動物モデルを用いた前臨床試験は、病態の理解に役立ち、新しいARDS治療研究に不可欠です。理想的な動物モデルは、臨床状況に似た特徴と、各疾患の病期、進化、および修復に関連する病態生理学的特徴を備えた疾患メカニズムの良好な再現性を備えている必要があります14。いくつかの動物モデルを使用して、ARDSの急性肺損傷を前臨床的に評価します。しかし、すべてのモデルには限界があるため、ヒトの病理を完全に再現することはできません6,14,16。オレイン酸誘発性ARDSは、異なる動物種で使用されている17。OA注射を投与されたブタ18、ヒツジ19、およびイヌ20は、肺胞毛細血管膜の機能不全と、タンパク質および細胞浸潤による透過性の増加を伴う疾患の多くの臨床的特徴を示す。
例えば、1.25 μMのOAを静脈内注射すると、経上皮輸送が遮断され、肺胞浮腫が生じた15。あるいは、A549細胞を用いたin vitroモデルでは、10 μMの濃度のOAは、上皮ナトリウムチャネル(eNAC)またはNa/K-ATPaseの発現を変化させませんでした。しかし、OAは両方のチャネルと関連しているようであり、それらの活動を直接阻害する21。0.1 mL / kgのOA静脈内注射は、肺組織のうっ血と腫れを引き起こし、肺胞中隔が肥厚して肺胞腔が減少し、炎症性血球数と赤血球数が増加しました22。また、OAは肺の内皮細胞および上皮細胞のアポトーシスおよび壊死を誘導した15。マウスの気管内におけるトリスオレイン酸溶液の注射は、刺激後6時間という早い時期に好中球浸潤および浮腫を増強した23。24時間でのOA注射は、炎症性サイトカインレベル(すなわち、TNF-α、IL-6、およびIL-1β)を増加させました23。さらに、10 μMのトリスオレイン酸の静脈内(眼窩神経叢)注射は、選択的酵素阻害剤である10-3 μMのウアバインと同様に、肺Na/K-ATPase活性を阻害します。また、OAは細胞浸潤、脂質体の形成、ロイコトリエンB4(LTB4)およびプロスタグランジンE2(PGE2)の産生を伴う炎症を誘発する22,24。したがって、オレイン酸誘発性ARDSは、浮腫、出血、好中球浸潤、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性の増加、およびROS24を生成します。したがって、OA投与は肺損傷の確立されたモデルです22,25。この記事で紹介したOAを含むすべての結果は、塩の形であるオレイン酸ナトリウムを表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
前臨床試験を実施するには、正しいARDSモデルを選択することが不可欠であり、評価者は、年齢、性別、投与方法など、考えられるすべての変数を考慮する必要があります6。選択したモデルは、敗血症、脂質塞栓症、肺血管系の虚血再灌流、およびその他の臨床リスクなどの危険因子に基づいて疾患を再現する必要があります14。しかし、ARDSに用いられた?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Instituto Oswaldo Cruz、Fundação Oswaldo Cruz(FIOCRUZ)、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001、Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF)、Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO)、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) によって資金提供されました。 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)です。図 1 と 図 2 は BioRender.com で作成されています。
Materials
| Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
| Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
| Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
| Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
| Drontal puppy | Bayer | N/A | |
| Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
| Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
| Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
| Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
| Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
| Ketamine | Syntec | N/A | |
| May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
| Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
| Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
| Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
| Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
| Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
| Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
| Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
| Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
| Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
| Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
| Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
| Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
| Xilazine | Syntec | N/A |
References
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