Modelo murino del síndrome de dificultad respiratoria aguda inducido por ácido oleico

Summary

El presente protocolo describe un modelo de lesión pulmonar en ratones que utilizan ácido oleico para imitar el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Este modelo aumenta los mediadores inflamatorios en el edema y disminuye la distensibilidad pulmonar. El ácido oleico se utiliza en forma de sal (oleato) ya que esta forma fisiológica evita el riesgo de embolia.

Abstract

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una amenaza significativa para los pacientes en estado crítico con una alta tasa de mortalidad. La exposición a contaminantes, el humo del cigarrillo, los agentes infecciosos y los ácidos grasos pueden inducir el SDRA. Los modelos animales pueden imitar el complejo mecanismo patológico del SDRA. Sin embargo, cada uno de ellos tiene limitaciones. En particular, el ácido oleico (OA) aumenta en pacientes críticos con efectos nocivos en el pulmón. La artrosis puede inducir lesión pulmonar por émbolos, alterando el tejido, alterando el pH y perjudicando la eliminación del edema. El modelo de lesión pulmonar inducida por artrosis se asemeja a varias características del SDRA con lesión endotelial, aumento de la permeabilidad alveolar, inflamación, formación de membrana hialina y muerte celular. En este trabajo, la inducción de la lesión pulmonar se describe mediante la inyección de OA (en forma de sal) directamente en el pulmón y por vía intravenosa en un ratón, ya que es la forma fisiológica de OA a pH 7. Por lo tanto, la inyección de artrosis en forma de sal es un modelo animal útil para estudiar la lesión pulmonar/SDRA sin causar émbolos ni alterar el pH, acercándose así a lo que está sucediendo en pacientes críticos.

Introduction

Ashbaugh et ^al.1, en 1967, describieron por primera vez el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y desde entonces han pasado por múltiples revisiones. De acuerdo con la definición de Berlín, el SDRA es una inflamación pulmonar que conduce a una insuficiencia respiratoria aguda e hipoxemia (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) debido al desequilibrio en la relación ventilación/perfusión, daño alveolar bilateral difuso (DAD) e infiltrado, aumento del peso pulmonar y edema ^2,3. El parénquima pulmonar es un entorno celular complejo compuesto por células epiteliales, endoteliales y de otro tipo. Estas células forman barreras y estructuras responsables del intercambio gaseoso y la homeostasis en los alvéolos³. Las células más abundantes dentro de la barrera epitelial son las células alveolares tipo I (AT1) con una mayor superficie para el intercambio gaseoso y la gestión de fluidos a través de Na/K-ATPasa. Además, las células alveolares tipo II (AT2) producen surfactante, reduciendo la tensión superficial en los alvéolos⁴. Por debajo, las células endoteliales forman una barrera semipermeable que separa la circulación pulmonar del intersticio. Sus funciones incluyen la detección de estímulos, la coordinación de respuestas inflamatorias y la transmigración celular⁵. Las células endoteliales también regulan el intercambio gaseoso, el tono vascular y la coagulación⁵. Por lo tanto, las alteraciones de la función endotelial y epitelial pueden exacerbar un fenotipo proinflamatorio, causando daño pulmonar que conduce al SDRA⁵.

El desarrollo de SDRA está asociado al riesgo de neumonía bacteriana y viral o a factores indirectos como sepsis no pulmonar, traumatismos, transfusiones de sangre y pancreatitis⁶. Estas condiciones provocan la liberación de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y patrones moleculares asociados al daño (DAMP), induciendo citocinas y quimiocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8⁵. El TNF-α está relacionado con la degradación de la cadherina vascular-endotelial (VE-cadherina) en la disrupción de la barrera endotelial y la infiltración de leucocitos en el parénquima pulmonar. Los neutrófilos son las primeras células en migrar, atraídas por IL-8 y LTB₄ ^5,7,8. Los neutrófilos aumentan aún más las citocinas proinflamatorias, las especies reactivas de oxígeno (ROS)⁹ y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) generando daño endotelial y epitelial adicional¹⁰. El daño epitelial provoca la inflamación y la activación de los receptores tipo Toll en las células AT2 y los macrófagos residentes, induciendo la liberación de quimiocinas que atraen las células inflamatorias a los pulmones⁴. Además, la producción de citoquinas como el interferón-β (INF_β) provoca receptores inductores de apoptosis (TRAIL) relacionados con el TNF, lo que lleva a las células ATII a la apoptosis, afectando el líquido y la claridad iónica⁴. La alteración de la estructura de la barrera endotelial y epitelial permite la entrada de líquido, proteínas, glóbulos rojos y leucocitos en el espacio alveolar, causando edema. Con el edema establecido, se altera el esfuerzo pulmonar para mantener la respiración y el intercambio gaseoso¹¹. La hipercapnia y la hipoxemia inducen la muerte celular y la alteración del transporte de sodio, agravando el edema alveolar debido a la escasa capacidad de aclaramiento¹⁰. El SDRA también tiene niveles elevados de IL-17A, asociada con disfunción orgánica, aumento del porcentaje de neutrófilos alveolares y permeabilidad alveolar⁹.

En los últimos años se han producido avances continuos en la investigación sobre la fisiopatología, la epidemiología y el tratamiento del SDRA^12,13. Sin embargo, el SDRA es un síndrome heterogéneo a pesar de los avances en la investigación terapéutica que han dado lugar a la optimización de la ventilación mecánica y la fluidoterapia. Por lo tanto, todavía se necesita un tratamiento farmacológico directo más eficaz¹⁰, y los estudios en animales pueden ayudar a desvelar los mecanismos y las dianas de intervención del SDRA.

Los modelos actuales de SDRA no son capaces de replicar completamente la patología. Por lo tanto, los investigadores a menudo eligen el modelo que mejor se ajusta a sus intereses. Por ejemplo, el modelo de inducción de lipopolisacáridos (LPS) induce SDRA por shock endotóxico desencadenado principalmente por TLR4¹⁴. La inducción de HCl imita la aspiración de ácido, y el daño es neutrofílico dependiente¹⁴. Por otro lado, el modelo actual de oleato de sodio induce daño endotelial que aumenta la permeabilidad vascular y el edema. Además, el uso de oleato de sodio en lugar de ácido oleico en forma líquida evita riesgos de embolia y alteración del pH^{sanguíneo 15}.

Modelos animales para el SDRA
Los estudios preclínicos en modelos animales ayudan a comprender la patología y son esenciales para la investigación de nuevos tratamientos para el SDRA. El modelo animal ideal debe tener características que se asemejen a la situación clínica y una buena reproducibilidad de los mecanismos de la enfermedad con características fisiopatológicas relevantes de cada estadio, evolución y reparación de la enfermedad¹⁴. Se utilizan varios modelos animales para evaluar preclínicamente la lesión pulmonar aguda en el SDRA. Sin embargo, como todos los modelos tienen limitaciones, no reproducen completamente la patología humana 6,14,16. El SDRA inducido por ácido oleico se utiliza en diferentes especies animales¹⁷. Los cerdos¹⁸, ovejas¹⁹ y perros²⁰ sometidos a inyección de artrosis presentan numerosas características clínicas de la enfermedad con disfunción de la membrana alveolar-capilar y aumento de la permeabilidad con infiltración de proteínas y células.

Por ejemplo, la artrosis inyectada por vía intravenosa a 1,25 μM bloqueó el transporte transepitelial que condujo a edema alveolar¹⁵. Por otra parte, en el modelo in vitro con células A549, la OA a una concentración de 10 μM no alteró el canal epitelial de sodio (eNAC) ni la expresión de Na/K-ATPasa. Sin embargo, la OA parece asociarse con ambos canales, inhibiendo directamente su actividad²¹. La inyección intravenosa de OA a 0,1 ml/kg causó congestión e hinchazón del tejido pulmonar, reducción de los espacios alveolares con tabiques alveolares engrosados y aumento del recuento de glóbulos rojos e inflamatorios²². Además, la artrosis indujo apoptosis y necrosis en células endoteliales y epiteliales del pulmón¹⁵. La inyección de una solución de tris-oleato, por vía intratraqueal en ratones, mejoró la infiltración de neutrófilos y el edema tan pronto como 6 h después de la estimulación²³. La inyección de artrosis a las 24 h aumentó los niveles de citoquinas proinflamatorias (es decir, TNF-α, IL-6 e IL-1β)²³. Además, la inyección intravenosa (plexo orbitario) de 10 μM de un tris-oleato inhibe la actividad pulmonar de la Na/K-ATPasa, similar a la ouabaína a ^10-3 μM, un inhibidor selectivo de la enzima. Además, la artrosis induce inflamación con infiltración celular, formación de cuerpos lipídicos y producción de leucotrieno B4 (LTB₄) y prostaglandina E2 (PGE₂)^22,24. Por lo tanto, el SDRA inducido por ácido oleico genera edema, hemorragia, infiltración de neutrófilos, aumento de la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) y ROS²⁴. Por lo tanto, la administración de artrosis es un modelo bien establecido para la lesión pulmonar^22,25. Todos los resultados presentados en este artículo que tiene OA representan la forma salina, oleato de sodio.

Protocol

Los procedimientos utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética en el Uso de Animales de la Fundación Oswaldo Cruz (licencias CEUA n°002-08, 36/10 y 054/2015). Para los experimentos se utilizaron ratones machos Swiss Webster de entre 20 y 30 g, proporcionados por el Instituto de Ciencia y Tecnología en Biomodelos (ICTB) de la Fundación Oswaldo Cruz (Fiocruz). Los animales fueron mantenidos en aisladores ventilados en el vivero del Pavilhão Ozório de Almeida, y el agua y el alimento estaban d…

Representative Results

En un pulmón no lesionado, el aclaramiento del líquido alveolar se produce por el transporte de iones a través de la capa epitelial alveolar intacta. El gradiente osmótico transporta líquido desde los alvéolos hasta el intersticio pulmonar, donde es drenado por los vasos linfáticos o reabsorbido. Na/K-ATPasa impulsa este transporte11. La artrosis es un inhibidor de la Na/K-ATPasa27 y del canal de sodio 21, lo que puede contribuir a la formación de edema, como ya hem…

Discussion

La selección del modelo correcto de SDRA es fundamental para la realización de los estudios preclínicos, y el evaluador debe considerar todas las variables posibles, como edad, sexo, métodos de administración, entre otras⁶. El modelo elegido debe reproducir la enfermedad en función de factores de riesgo como sepsis, embolia lipídica, isquemia-reperfusión de la vasculatura pulmonar y otros riesgos clínicos¹⁴. Sin embargo, ningún modelo animal utilizado para el SDRA…

Materials

Anesthetic vaporizer	SurgiVet	model 100
Braided slik thread with needle number 5	Shalon medical	N/A
Cabinet vivarium	Insight	Model EB273
Centrifuge	Eppendorf	5430/5430R
Cytofunnel	ThermoFisher	11-025-48
Drontal puppy	Bayer	N/A
Hank's balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4981
Heatpad	tkreprodução	TK-500
Hydrocloric Acid	Sigma-Aldrich	30721
Insulin syringe Ultrafine	BD	328322
Isoforine 1mL/mL	Cristália	N/A
Ketamine	Syntec	N/A
May-Grunwald-Giemsa	Sigma-Aldrich	205435
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23235
Microscope  PrimoStar	Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA	R&D system	DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA	R&D system	DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA	R&D system	DY410
Neubauer chamber improved bright-line	Global optics
Oleic Acid (99%)	Sigma-Aldrich	O1008
Osmium tetroxide solution (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G	BD Angiocath	388333
Prism 8 (graphic and statistic software)	Graphpad	N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal	Cayman Chemical	514010
Shandon Cytospin 3	ThermoFisher	N/A
Sodium hydroxide	Merck	1,06,49,81,000
Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice	ICTB/FIOCRUZ	N/A
Syringe 1 mL	BD	990189
Tris-base	Bio Rad	161-0719	Electrophoresis purity reagent
Türk's solution	Sigma-Aldrich	93770
Xilazine	Syntec	N/A