이 프로토콜은 시험관내에서 14CO2생산을 추적함으로써 기질 산화를 검사하는 사용하기 쉬운 방법을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 에너지 항상성을 유지하기 위해 아데노신 삼인산염(ATP)을 생성하는 트리카르복실산(TCA) 사이클 및 전자 수송 사슬(ETC)을 위한 기계장치를 호스트한다. 포도당, 지방산 및 아미노산은 대부분의 체세포에서 미토콘드리아 호흡을 촉진하는 주요 에너지 기질입니다. 증거는 상이한 세포 유형이 특정 기질에 대해 뚜렷한 선호도를 가질 수 있음을 보여준다. 그러나, 골격 내의 다양한 세포에 의한 기질 활용은 구체적으로 연구되지 않았다. 더욱이, 세포 대사가 생리학적 및 병리생리학적 변화에 적응함에 따라, 골격 세포에서의 기질 의존성에 대한 직접적인 평가는 뼈 질환의 발병기전에 대한 중요한 통찰을 제공할 수 있다.
다음 프로토콜은 산화 인산화 후 기질 분자로부터 이산화탄소가 방출되는 원리에 기초한다. 방사성으로 표지된 탄소 원자(14C)를 함유하는 기질을 사용함으로써, 이 방법은 세포 배양물에서 기질 산화의 속도에 대한 민감하고 사용하기 쉬운 검정을 제공한다. 일차 calvarial preosteoblasts 대 골수 유래 대식세포 (BMMs)를 사용한 사례 연구는 두 세포 유형 사이의 주요 기질의 다른 활용을 보여줍니다.
서론
진핵생물의 산화적 인산화(OXPHOS)는 미토콘드리아 내부에서 영양분이 분해되어 산소 소비를 통해 ATP 형태로 화학 에너지를 방출하는 과정입니다. 트리카르복실산(TCA) 사이클을 통해 미토콘드리아 내부의 다양한 기질의 이화작용은 직접 ATP 분자를 거의 생성하지 않지만, 오히려 전자 운반체인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD+)의 환원을 통해 에너지를 저장한다. 환원된 담체는 이어서 미토콘드리아의 내막에 위치한 ETC에 의해 산화되어 막을 가로질러 양성자 농도 구배를 생성한다. 양성자는 결국 ATP 신타제를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 다시 구배를 흘러 ATP를 생성합니다. OXPHOS는 에너지 기질로부터 ATP를 생산하는 가장 효율적인 수단이며 일반적으로 호기성 환경에서 선호됩니다. 이전에, 호기성 글리코분해-산소가 존재하는 동안 글루코스로부터의 락테이트의 생산-병리생리학적, 종종 암 세포의 특징인 것으로 생각되었다. 점점 더 많은 수의 정상적인 세포 유형이 아직 완전히 해독되지 않은 이유로 호기성 글리코 분해를 사용한다는 것이 발견되고 있습니다.
대사 유연성은 세포 또는 유기체가 변화하는 에너지 요구와 사용 가능한 연료 원에 적응할 수있는 능력....
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프로토콜
방사성 물질(RAM)을 사용하려면 각 기관의 지정된 안전위원회의 사전 승인이 필요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 RAM은 펜실베니아 대학의 환경 보건 및 방사선 안전 (EHRS)의 승인을 받았습니다. 동물을 사용하려면 가정 기관의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 사전 승인이 필요합니다. 다음 연구는 필라델피아 아동 병원의 IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 14C 표지 기판에 대한 스톡 용액 제조
- BSA 11g과 둘베코 인산완충식염수(DPBS) 33.1mL를 혼합하여 4mM 소혈청알부민(BSA) 원액을 만들고 BSA가 완전히 용해될 때까지 실온에서 ~3시간 동안 부드럽게 흔들어 준다. BSA 원액을 사용 전에 70°C 수조에서 가온한다.
- 공기 건조 50 μCi 14C-올레에이트 (에탄올 중 50 μCi / μmol)를 지정된 RAM 작업 후드에서 8 시간 동안 뚜껑을 떼어 낸 바이알에 넣으세요. 312.5 μL의H2O를 첨가한 다음, 3.5 mg(11.5 μmol)의 올레산나트륨을 첨가한다. 철저히 섞으십시오.
- 생성된 용액을 수조에서 70....
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결과
이 예에서,CO2 포획 방법은 각각 시험관내 조골세포 또는 파골세포 분화에 자주 사용되는 BMMs와 일차 갈변 전조골세포에 의한 기질 산화를 비교하기 위해 사용된다. 일차 세포가 계대배양되고 cMEMα에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 합류의 80-90%에 도달하고 그들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial preosteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다 (그림 2). 각 세포 유형은 다음 단계 4.1 내지 4.7에 의해 글루코스, 글루타민 및 올레에이트에 대한 산화 검정을 실시한다. 결과는 Eq (1)을 사용하여 분석한다.
결과는 각 기질에 대한 산화율이 BMM보다 칼바리알 전조아세포에서 유의하게 더 높으며, 조골세포 전에서 OXPHOS에 의한 더 큰 에너지 생산을 나타낼 가능성이 있음을 보여준다(
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토론
이 프로토콜은 주요 에너지 기판의 산화 속도를 결정하는 데 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 중앙 우물을 포함하고 고무 마개14,15,16으로 덮인 플라스크를 사용하는 다른 프로토콜에 대한 간단한 대안입니다. 여기서 예시적인 연구가 세포 배양과 함께 수행되지만, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이 무손상 미토콘드리아를 함유하는 조직 외식편 또는 조직 균질물에 대해 용이하게 적응될 수 있다(17).
이 프로토콜에서 고려해야 할 몇 가지 주요 단계는 시약의 준비 및 14CO2포획을 위한 튜브의 셋업을 포함한다. 올레에이트를 BSA에 적절히 컨쥬게이션시키는 것은 유리 지방산(FFA)이 세포막을 손상시키는 것을 방지하고 신진대사를 위해 세포.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH 보조금 R01 AR060456 (FL)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 마이클 로빈슨 박사와 엘리자베스 크리즈만(필라델피아 아동 병원)에게 섬광 카운터에 대한 아낌없는 도움을 주신 것에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 필터 | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | BSA 용액 |
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200056 | 세포 배양 플레이트에서 세포 해리 |
| 1.5 mL Eppendorf 튜브 | PR1MA | PR MCT17 RB | 반응 배양에 사용 |
| 10cm 플레이트 | TPP | 93100 | 세포 배양에 사용 |
| 10 mL 주사기 | BD | 302995 | 긴 뼈에서 골수를 씻어내는 데 사용 |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | 세포 배양 배지 준비 |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | 뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다 |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | 뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다 |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | 뜨거운 매체를 만드는 데 사용 |
| 23 G 바늘 | BD | 305120 | 긴 뼈에서 골수를 씻어내는 데 사용 |
| 24 웰 플레이트 | TPP | 92024 | 세포 배양에 사용 |
| 70 μ m cell strainers | MIDSCI | 70CELL | cavarial digestion 중 상등액을 여과하는 데 사용 |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | 종자 밀도를 결정하기 위해 살아있는 세포를 염색 |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | 지방산 접합에 사용 |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | 생존 가능한 세포의 수 결정 | |
| 원심분리기 | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | 세포 펠렛화에 사용 |
| 콜라겐분해효소 II형 | Worthington | LS004176 | 조직에서 세포 해리 |
| 맞춤형 MEM 알파 | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | 맞춤형 핫 미디어를 만드는 데 사용 |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Gibco | 10010023 | 시약을 용해 및 희석하고 배양 접시를 세척하는 데 사용됩니다 |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | 세포 |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 트랩 CO2 |
| -카르니틴 | Sigma-Aldrich | C0283 | 지방산 산화를 위해 보충됨 |
| L-글루타민 | Sigma-Aldrich | g3126 | 맞춤형 배지 |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | 세포 배양 배지 |
| Parafilm | Pecheney 플라스틱 포장 | PM998 | 세포 배양 접시를 밀봉하는 데 사용 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher | 15140122 | 세포 배양 오염 방지 |
| 과염소산 | Sigma-Aldrich | 244252, | 대사 분석 중 CO2 방출 |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | 맞춤형 매체를 만드는 데 사용 |
| 섬광 카운터 | Beckman Coulter | LS6500 | 여과지에서 방사능 측정 |
| 섬광 유체 | MP Biomedicals | 882453 | RAM에서 방출되는 에너지를 흡수하고 섬광으로 다시 방출 |
| 섬광 바이알 | Fisher Scientific | 03-337-1 | 섬광 유체용 반응 용기 |
| 탄산나트륨 | Sigma-Aldrich | S5761 | 용 균형 버퍼 |
| Sigma-Aldrich | 58045 | 메타보일C 분석 중 CO2 트랩 | |
| 올레산나트륨 | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA 공액 지방산 준비 |
| 진공 여과 1000 | TPP | 99950 | 필터 cMEMα |
참고문헌
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
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재인쇄 및 허가
