Denne artikkelen beskriver en metode for sterilisering av ormplukk, spatler og skalpeller ved hjelp av en mikroforbrenningsovn i stedet for en åpen flamme.
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) er en optimal modellorganisme for forskning og utdanning ved primært bachelorinstitusjoner. Undergraduates kan raskt lære den sterile teknikken som kreves for å opprettholde C. elegans kulturer. Sterilisering av platinaplukk som brukes til å overføre ormer fra en tallerken til en annen, gjøres tradisjonelt ved å holde plukket i en flamme fra en Bunsen-brenner eller etanollykt. Bunsen-brennere krever imidlertid en gasskilde, og begge utstyrsdelene utgjør risikoen for utilsiktet brann forbundet med åpen flamme. Demonstrert her er en teknikk for sterilisering av ormvalg, spatler og skalpeller ved hjelp av en infrarød bakteriologisk sløyfe mikroforbrenningsovn. Dette utstyret krever bare en stikkontakt og minimerer potensielle brannfarer. Ved å senke risiko- og gasskravene er denne teknikken velegnet til forskning og undervisning i en bachelor setting.
Modellorganismen C. elegans er velegnet for både forskning og utdanning ved primært lavere institusjoner (PUIer) på grunn av lave kostnader, enkel vedlikehold og anvendelsesområde 1,2,3,4. For å håndtere ormer – for eksempel for å flytte en orm fra en plate til en annen, kan eksperimentere bruke et ormplukk. En rekke valg kan gjøres eller kjøpes for bruk med C. elegans. Picks er vanligvis laget ved hjelp av en platina- eller platina/ iridiumspiss, montert i et glass-, metall- eller trehåndtak. Glasshåndtak kan gjøres internt ved å smelte en Pasteur pipette rundt en platinatråd til ledningen er sikker. Ytterligere informasjon om C. elegans husdyrhold, inkludert hvordan man vokser og vedlikeholder ormer og deres matkilder, finnes i WormBook5 og andre kilder 6,7,8.
Når du arbeider med C. elegans, brukes aseptiske teknikker vanligvis for å forhindre forurensning med mikrober og sopp. Eksempler på aseptiske teknikker inkluderer sterilisering av instrumenter, autoklavering av reagenser og gjennomføring av arbeid i sterile felt. Ormplukkinger steriliseres vanligvis ved hjelp av åpen flamme9. I tillegg plukker sterilisering av ormen forbrenner ormer, og forhindrer dermed utilsiktet blanding av stammer når du arbeider med flere ormstammer. Typiske metoder for sterilisering av ormvalg innebærer åpen flamme fra enten en Bunsen-brenner, etanollykt eller standard lighter (tabell 1). Vi ble motivert til å søke tryggere alternativer til eksisterende metoder i laboratoriet da en bachelorstudent uvitende sølte etanol mens han fylte en etanollykt og ved et uhell startet en liten brann når han antente lykten. Dessverre er det rapportert mange ulykker ved hjelp av etanollykter 10,11,12. Heldigvis er alternative steriliseringsmetoder validert for bruk i mikrobiologi, og formålet med denne artikkelen er å demonstrere hvordan du bruker dette utstyret til å sterilisere instrumenter for bruk med C. elegans.
I mikrobiologiske laboratorier er aseptisk teknikk også kritisk. Serologiske løkker og ledninger laget av platina steriliseres enten ved hjelp av åpen flamme13 eller en mikroforbrenningsovn 14,15,16. Andre navn på mikroforbrenningsovner inkluderer mikrosterilisatorer eller bactoforbrenningsovner. Fordelene med mikroforbrenningsapparatet over tradisjonelle flammemetoder inkluderer redusert brannfare, eliminering av sprut av brente materialer og evne til å jobbe i en laminær strømningshette / biosikkerhetsskap 16,17,18. Faktisk anbefaler både American Society of Microbiology og Verdens helseorganisasjon å bruke mikroforbrenningsovner over bruk av en åpen flamme 17,19,20. Sammenlignet med Bunsen-brennere krever mikroforbrenningsovner heller ikke en gassledning, som noen laboratorier kanskje ikke har, eller kanskje ikke har plassert på hver benk for studenter å bruke. Inspirert av disse fordelene ble det utviklet en protokoll for å erstatte bruken av flamme med mikroforbrenningsovner for sterilisering av vanlige instrumenter som picks, spatulas og skalpeller i C. elegans-laboratoriet. Denne metoden kan være egnet for instruktører og forskere som ønsker å forbedre sikkerheten og/eller fleksibiliteten når de arbeider med C. elegans.
C. elegans er en modellorganisme som er godt egnet for øvelser i undervisningslaboratorier. Bruk av mikroforbrenningsovner i stedet for åpne flammer gir fordeler i både forskningslaboratorier og klasseromslaboratorier. Faktisk kan bachelor laboratoriekurs utgjøre en høyere risiko for utilsiktede branner gitt antall nyutdannede forskere i rommet. I tillegg øker risikoen for brann når etanol brukes til å sterilisere instrumenter nær flammekilden, da etanoldamp er antennelig. Bærbarheten gir også en fordel for klasserom der gassledninger ikke er installert på hver benk. Denne metoden har vært benyttet i undervisnings- og forskningslaboratorier ved vår institusjon, noe som ikke har resultert i noen økning i forurensning og null laboratoriesikkerhetsulykker siden innlemmelsen i 2016.
For å sikre kompatibilitet med mikroforbrenningsovner ble en rekke valg med forskjellige monteringer, trådsammensetninger og trådmålere testet. Trådsammensetning inkluderte 100% platina samt 90% platina / 10% iridium med en trådtykkelse på 30-32 G, og uavhengig av tykkelse og sammensetning kompromitterte oppvarmingsmetoden ikke trådintegritet. Monteringene inkluderte to forskjellige typer kommersielt tilgjengelige pick-håndtak og egenlagde glassmonteringer fra Pasteur-pipetter. Vær oppmerksom på at valgene ikke lyser rødt som de gjør i flammen. Imidlertid oppnås tilstrekkelig sterilisering fortsatt så lenge sterilisatoren har nådd riktig temperatur. Dermed er det viktig å la mikroforbrenningsovnen varme opp i 10 eller 20 min, som angitt i produsentens instruksjoner. Å holde instrumentet i kammeret i minst 5 s for å oppnå sterilisering er også kritisk. Å forlate instrumentet i kammeret lenger enn 7 s vil ikke forårsake skade på instrumentet, men er unødvendig. Selv om dette er en relativt grei prosedyre med minimale trinn og sannsynligvis ikke trenger feilsøking, kan det ta litt øvelse å lære å stabilisere instrumentet i fatet uten å berøre sidene.
For å erstatte en åpen flamme må en steriliseringsmetode dekke alle bruksområdene som brukes i et laboratorium. I tillegg til steriliseringsinstrumenter kan C. elegans laboratorier også bruke Bunsen-brennere til å lage et sterilt felt for å gjøre andre oppgaver som å helle plater eller inokulere kulturer13. Men om dette skaper et sterilt felt eller trekker inn fortsatt levedyktige forurensninger, forblir kontroversielt14. Selv om det ikke er et alternativ ved alle institusjoner, kan et biosikkerhetsskap eller laminær strømningshette brukes til disse formålene, slik at et laboratorium kan fungere uten bruk av åpne flammer. Bruksanvisninger for de fleste mikroforbrenningsovner anbefaler mot bruk for sterilisering av skalpellblader fordi skraping av de indre veggene skader sterilisatoren. Men hvis man forsiktig bruker en guide, kan man sterilisere et skalpellblad eller spatel uten å berøre de indre veggene. Dette utvider bruken av teknikken for å tillate chunking uten å bruke flamme og gjør det mulig for et C. elegans-laboratorium å fungere uten å bytte teknikker mellom sterilisering av forskjellige gjenstander.
Som beskrevet i tabell 1, tilbyr mikroforbrenningsovner økt sikkerhet, økt kompatibilitet med laminære strømningshetter og økt bærbarhett over flammebaserte metoder, men har begrensninger. De er dyrere enn de andre metodene og krever oppvarmingstid før steriliseringstemperaturer oppnås. Til slutt kan denne metoden som rutinemessig brukes i mange mikrobiologiske laboratorier, være anvendelig i noen C. elegans forsknings- og undervisningslaboratorier som søker å forbedre laboratoriesikkerheten uten å gå på kompromiss med steriliteten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Suzanne Howard og Justin Finne. Dette arbeidet ble finansiert av Wellesley College Neuroscience Department. N2 ormer ble levert av CGC som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Publiseringsgebyrene for denne artikkelen ble støttet av Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
N2 worms | CGC | N2 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
Petri dish | Fisher | 08-772B | |
Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |