В этой статье описывается метод стерилизации червячных отрубей, шпателей и скальпелей с использованием микроинсинератора вместо открытого огня.
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) является оптимальным модельным организмом для исследований и образования в первую очередь в высших учебных заведениях. Студенты могут быстро освоить стерильную технику, необходимую для поддержания культур C. elegans . Стерилизация платиновых отмычек, используемых для переноса червей с одной пластины на другую, традиционно выполняется путем удержания кирки в пламени от горелки Бунзена или этанолового фонаря. Однако горелки Бунзена требуют источника газа, и оба элемента оборудования представляют риск случайного пожара, связанного с открытым пламенем. Здесь показана методика стерилизации червячных кирок, шпателей и скальпелей с использованием инфракрасного бактериологического петлевого микросинератора. Это оборудование требует только электрической розетки и минимизирует потенциальную опасность пожара. Снижая требования к риску и газу, этот метод хорошо подходит для исследований и преподавания в условиях бакалавриата.
Модельный организм C. elegans хорошо подходит как для исследований, так и для образования в преимущественно бакалаврских учреждениях (PUI) благодаря низкой стоимости, простоте обслуживания и диапазону применения 1,2,3,4. Для того чтобы обращаться с червями — например, перемещать червя с одной тарелки на другую, экспериментаторы могут использовать червячную кирку. Различные кирки могут быть сделаны или приобретены для использования с C. elegans. Кирки чаще всего изготавливаются с использованием платинового или платинового / иридиевого наконечника, установленного в стеклянной, металлической или деревянной ручке. Стеклянные ручки могут быть изготовлены собственными силами путем плавления пипетки Пастера вокруг платиновой проволоки до тех пор, пока проволока не станет надежной. Дополнительную информацию о разведении C. elegans, в том числе о том, как выращивать и поддерживать червей и их источники пищи, можно найти в WormBook5 и других источниках 6,7,8.
При работе с C. elegans обычно используются асептические методы для предотвращения загрязнения микробами и грибами. Примеры асептических методов включают стерилизацию инструментов, автоклавирование реагентов и проведение работ в стерильных полях. Червячные кирки обычно стерилизуют с использованием открытогоогня 9. Кроме того, стерилизация червячной кирки сжигает червей, тем самым предотвращая случайное смешивание штаммов при работе с несколькими штаммами червей. Типичные методы стерилизации червячных отборов включают открытое пламя от горелки Бунзена, этанолового фонаря или стандартной зажигалки (таблица 1). Мы были мотивированы искать более безопасные альтернативы существующим методам в лаборатории, когда студент бакалавриата неосознанно пролил этанол, заполняя этаноловый фонарь, и случайно начал небольшой пожар при зажигании фонаря. К сожалению, было зарегистрировано много несчастных случаев с использованием этаноловых фонарей 10,11,12. К счастью, альтернативные методы стерилизации были проверены для использования в микробиологии, и цель этой статьи – продемонстрировать, как использовать это оборудование для стерилизации инструментов для использования с C. elegans.
В микробиологических лабораториях асептический метод также имеет решающее значение. Серологические петли и провода из платины стерилизуются либо с использованием открытогоогня 13, либо микросинератора 14,15,16. Другие названия микросинераторов включают микростерилизаторы или бакто-мусоросжигательные заводы. Преимущества микроинсинератора перед традиционными методами пламени включают снижение пожароопасности, устранение разбрызгивания сжигаемых материалов и возможность работы в ламинарной вытяжке /шкафу биобезопасности 16,17,18. Фактически, как Американское общество микробиологии, так и Всемирная организация здравоохранения рекомендуют использовать микросинераторы вместо использования открытогоогня 17,19,20. По сравнению с горелками Бунзена, микросинераторы также не требуют газовой магистрали, которой некоторые лаборатории могут не иметь или не иметь на каждой скамейке для использования студентами. Вдохновленный этими преимуществами, был разработан протокол для замены использования пламени микро-мусоросжигательными установками для стерилизации широко используемых инструментов, таких как кирки, шпатели и скальпели в лаборатории C. elegans. Этот метод может быть подходящим для инструкторов и исследователей, стремящихся повысить безопасность и / или гибкость при работе с C. elegans.
C. elegans является модельным организмом, хорошо подходящим для упражнений в учебных лабораториях бакалавриата. Использование микросинераторов вместо открытого огня обеспечивает преимущества как в исследовательских лабораториях, так и в аудиторных лабораториях. Фактически, лабораторные курсы бакалавриата могут представлять более высокий риск случайных пожаров, учитывая количество недавно обученных ученых в комнате. Кроме того, риск возгорания возрастает, когда этанол используется для стерилизации инструментов вблизи источника пламени, поскольку пары этанола воспламеняются. Портативность также дает преимущество для классных комнат, где газовые линии не установлены на каждой скамейке. Этот метод использовался в учебных и исследовательских лабораториях нашего учреждения, что привело к отсутствию увеличения загрязнения и нулевым несчастным случаям в лабораторных условиях с момента его создания в 2016 году.
Для обеспечения совместимости с микроинсинераторами был протестирован ряд отмычек с различными креплениями, составами проволоки и проволочными датчиками. В состав проволоки входило 100% платина, а также 90% платина/10% иридий с толщиной проволоки 30-32 Г, и независимо от толщины и состава, способ нагрева не ставил под угрозу целостность проволоки. Крепления включали в себя два различных типа коммерчески доступных ручек и стеклянные крепления собственного производства от пипеток Pasteur. Обратите внимание, что кирки не светятся раскаленными, как в пламени. Тем не менее, достаточная стерилизация все еще достигается до тех пор, пока стерилизатор достигает надлежащей температуры. Таким образом, крайне важно дать микроинсинератору прогреться в течение 10 или 20 минут, как указано в инструкции производителя. Хранение инструмента в камере в течение не менее 5 с для достижения стерилизации также имеет решающее значение. Оставление инструмента в камере дольше 7 с не причинит вреда инструменту, но не является необходимым. Хотя это относительно простая процедура с минимальными шагами и вряд ли потребует устранения неполадок, может потребоваться некоторая практика, чтобы научиться устанавливать инструмент в стволе, не касаясь сторон.
Чтобы заменить открытое пламя, метод стерилизации должен охватывать все приложения, используемые в лаборатории. В дополнение к стерилизующим инструментам, лаборатории C. elegans могут также использовать горелки Бунзена для создания стерильного поля для выполнения других задач, таких как заливка пластин или инокуляция культур13. Однако вопрос о том, создает ли это стерильное поле или втягивает все еще жизнеспособные загрязняющие вещества, остается спорным14. Хотя это не вариант во всех учреждениях, для этих целей можно использовать шкаф биобезопасности или ламинарный вытяжку, что позволяет лаборатории функционировать без использования открытого огня. Инструкции по эксплуатации для большинства микроинсинераторов рекомендуют не использовать для стерилизации лезвий скальпеля, поскольку соскоб внутренних стенок повреждает стерилизатор. Однако при осторожном использовании направляющей можно стерилизовать лезвие скальпеля или шпатель, не касаясь внутренних стенок. Это расширяет использование метода, позволяющего дробить без использования пламени и позволяет лаборатории C. elegans функционировать без переключения методов между стерилизацией различных объектов.
Как указано в таблице 1, микросинераторы обеспечивают повышенную безопасность, повышенную совместимость с ламинарными проточными вытяжками и повышенную портативность по сравнению с методами, основанными на пламени, но имеют ограничения. Они являются более дорогостоящими, чем другие методы, и требуют времени прогрева до достижения температуры стерилизации. В заключение, этот метод, который обычно используется во многих микробиологических лабораториях, может быть применим в некоторых исследовательских и учебных лабораториях C. elegans , стремящихся повысить лабораторную безопасность без ущерба для стерильности.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить Сюзанну Ховард и Джастина Финна. Эта работа финансировалась департаментом неврологии колледжа Уэллсли. Черви N2 были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Плата за публикацию этой статьи была поддержана Фондом открытого доступа библиотеки и технологических услуг колледжа Уэллсли.
90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
N2 worms | CGC | N2 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
Petri dish | Fisher | 08-772B | |
Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |