خرائط Mycorrhizal كأداة لاستكشاف أنماط الاستعمار والاستراتيجيات الفطرية في جذور Festuca rubra و Zea mays
Summary
يصف البروتوكول هنا طرق تقييم أنماط الاستعمار الفطري المفصلي والاستراتيجية في الجذور لنوعين: Zea mays و Festuca rubra. يسمح استخدام طريقة MycoPatt بحساب المعلمات ، وتحويل الهياكل الفطرية إلى بيانات رقمية ، ورسم خرائط لموقعها الحقيقي في الجذور.
Abstract
الفطريات الفطرية المفصلية هي متكافلات في جذور النباتات. ويتمثل دورها في الحفاظ على تنمية المضيف والحفاظ على التوازن الغذائي في النظم الإيكولوجية. تعتمد عملية الاستعمار على عدة عوامل مثل بيئة التربة ، والتنوع الجيني للفطريات والمضيف ، والممارسات الزراعية. يؤدي عملها المتزامن إلى تطوير شبكة واصلة معقدة ويؤدي إلى التطور الثانوي للحويصلات والمفصليات في الخلايا الجذرية. كان الهدف من هذا البحث هو تحليل كفاءة طريقة أنماط الميكوريزال (MycoPatt) لتحديد مواقع الهياكل الفطرية في جذور Festuca rubra و Zea mays. كان الهدف الآخر هو استكشاف استراتيجية الاستعمار الفطري كما كشفت عنها الخرائط الفطرية لكل نوع. يسمح الحصول على صور مجهرية متعددة وتجميعها بتقييم الاستعمار الفطري في كل من نباتات الذرة والبراز الأحمر لتوفير معلومات عن الوضع الواقعي للهياكل المتقدمة. تسلط أنماط الميكوريزال المرصودة الضوء على الكفاءة المتغيرة لكل نبات من حيث تطوير الروابط مع الفطريات التكافلية للتربة ، الناجمة عن العلاجات التطبيقية ومرحلة النمو. الخرائط التفصيلية Mycorrhizal التي تم الحصول عليها من خلال طريقة MycoPatt مفيدة للكشف المبكر عن كفاءة النبات في الاستحواذ التكافلي من التربة.
Introduction
فطريات الميكوريزا المفصلية (AM) هي فئة من النباتات الداخلية التي تنقلها التربة والتي تعد باستمرار مجالا لاهتمام الباحثين. وجودها في جذور معظم النباتات ومشاركتها في دورات المغذيات يجعلها مكونات حيوية في استقرار كل نظام بيئي حيث توجد النباتات العشبية 1,2. من خلال الميسيليوم خارج الجذر ، يعمل AM كامتداد فطري لجذور النباتات ، خاصة في المناطق التي يصعب الوصول إليها3. النشاط الرئيسي هو في جذور النباتات المضيفة ، حيث تقوم AM بتطوير شبكات hyphae كبيرة وهياكل محددة داخل الخلايا تسمى arbuscules. يسمح عدم وجود خصوصية للمضيف للتكافل باستعمار أنواع متعددة في نفس الوقت. توفر هذه القدرة ل AM دور تخصيص الموارد وتنظيم المغذيات في النظام الإيكولوجي ؛ يوفر الفطر أيضا الدعم في بقاء النبات ويساعد في أداء النبات4،5،6،7. يكون تفاعل أنواع AM مع الجذور المضيفة مرئيا في امتداد وموقع الميسيليوم داخل الجذر ووجود وشكل المفصليات التي تطورت داخل الخلايا. تعمل المفصليات داخل الخلايا كنقطة تبادل بين المتكافلتين وتمثل مناطق تتميز بعمليات نقل سريعة. تعتمد الهياكل التي تنتجها AM على الأنواع ، وبالإضافة إلى arbuscules ، في الجذور ، فإنها تطور أيضا حويصلات وجراثيم وخلايا مساعدة.
هناك العديد من التحديات في تقييم التكافل AM في جذور النباتات 8,9. الأول هو تطورها المستمر خلال فترة الغطاء النباتي بأكملها للمضيفين ، مما يؤدي إلى تغييرات متعددة في البنية المفصلية الواصلة. المراحل المختلفة من النمو المفصلي ، حتى انهيارها ، موجودة بوضوح في الجذور ، ولكن يتم هضم هياكل AM الشائخة في بعض الأحيان ، مما يجعلها مرئية جزئيا فقط10. ويتمثل التحدي الثاني في طريقة التلطيخ وبروتوكوله ، والتنوع الكبير في أنظمة الجذر ، وأبعاد خلاياها ، والاختلافات في السمك ، مما يجعل من الصعب اقتراح طريقة موحدة. ويتمثل التحدي الأخير في تقييم وتسجيل الاستعمار AM. هناك العديد من الطرق التي تسجل AM بدرجات مختلفة من الموضوعية ، ولا يزال معظمها مقتصرا على تقنيات الفحص المجهري. تعتمد الهياكل البسيطة على وجود / عدم وجود هياكل في قشرة الجذر ، في حين أن الهياكل الأكثر تعقيدا تستند إلى التسجيل البصري واستخدام فئات الاستعمار ، مع دمج تواتر وشدة ظاهرة الاستعمار. تم إنتاج الكثير من البيانات في العقود الأخيرة حول الحالة الفطرية لأنواع متعددة ، ولكن معظم الطرق تقتصر على القيمة الملحوظة للاستعمار دون الإشارة إلى الموقع الحقيقي لكل هيكل في قشرة الجذر. استجابة لضرورة الحصول على نتائج أكثر دقة حول استعمار AM ، تم تطوير طريقة تعتمد على التحليل المجهري لأنماط mycorrhizal (MycoPatt) في الجذور لتجميع ، في شكل رقمي ، خرائط mycorrhizal التفصيلية11. أيضا ، تسمح الطريقة بالحساب الموضوعي لمعلمات الاستعمار وتحديد الموضع الفعلي لكل هيكل في الجذر.
يمكن أن يكون موضع الهياكل الفطرية AM مهما في الإجابة على السؤالين التاليين. الأول يتعلق بتحليل الاستعمار في لحظة واحدة محددة من دورة الغطاء النباتي للنبات. في هذا السياق ، من المفيد جدا مراقبة وفرة المفصليات / الحويصلات ، والإبلاغ عن كيفية وجودها في الجذر ، وتقديم صورة ومعلمات استعمارية واضحة للغاية. والثاني يتعلق بالكشف عن الاستراتيجية الفطرية وتوجهها وحتى التنبؤ بتطورها المستقبلي. يمكن أن يكون أحد تطبيقات MycoPatt للنباتات التي يتم تحليلها يوميا ، كل 2-3 أيام ، أسبوعيا ، أو خلال مراحل النمو المختلفة. في هذا السياق ، يعد موقع الحويصلات / arbuscules مهما لفهم الآلية البيولوجية لاستعمار AM بشكل أفضل. هذه المعلمات والملاحظات مفيدة جدا لتكملة المعلمات الرياضية.
الهدف من هذه المقالة هو إظهار قدرة نظام MycoPatt على استكشاف إمكانات واستراتيجية استعمار الفطريات AM الأصلية في جذور Zea mays (الذرة) خلال مراحل التطور المختلفة وفي جذور Festuca rubra (الفسكو الأحمر) في ظل ظروف إخصاب مختلفة طويلة الأجل. لتحقيق الهدف ، تم تحليل قاعدتي بيانات كبيرتين من تجربتين. تم تأسيس تجربة الذرة في كوجوكنا (46°44′56″ lat. N و 23°50′0″ طويلة. E) ، في المزرعة التعليمية التجريبية بجامعة العلوم الزراعية والطب البيطري كلوج على phaeoziom مع تربة طميية الملمس12. تجربة الفسكو الأحمر هي جزء من موقع تجريبي أكبر تم إنشاؤه في عام 2001 في غيتشاري ، جبال أبوسيني (46 ° 49’064 ” lat. N و 22 ° 81’418 ”’ طويلة. E) ، على نوع التربة preluvosol (terra rossa)13,14. تم جمع الذرة في خمس مراحل ظاهرية مختلفة للنمو12: B1 = 2-4 أوراق (كنقطة تحكم لبدء الاستعمار الفطري) ؛ B2 = 6 أوراق; B3 = 8-10 أوراق ؛ B4 = تكوين قطعة خبز. B5 = النضج الفسيولوجي. بدءا من مرحلة 2-4 أوراق (A0) ، تم تطبيق معالجة عضوية ، مما أدى إلى عامل التخرج المزدوج (A1 = التحكم و A2 = المعالجة). تم جمع جذور الفسكو الأحمر عند الإزهار من تجربة مع خمسة تسميد طويل الأجل13,14: V1 = التحكم ، غير المخصب. V2 = 10 t·ha-1 السماد; V3 = 10 t·ha-1 السماد + N 50 كجم ·ha-1 ، P 2 O5 25 kg·ha-1 ، K2O 25 kg ·ha-1 ؛ V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 السماد + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. تم جمع خمسة نباتات في كل مرحلة تطوير من كل متغير تسميد. تم تحليل بروتوكولات التلطيخ وأدائها من حيث وقت معالجة العينات وجودة التلطيخ. تم تحليل العلاقة بين تطور AM-hyphae ووجود هياكلها في الجذور بشكل منفصل لكل نوع واستمرت مع تحديد الجذور الأكثر تساهلا للاستعمار. تم تحليل أنماط الاستعمار المحددة لكل نظام جذر بناء على خرائط الاستعمار وقيمة معلمات AM.
الذرة هي نبات سنوي ، مما يعني النمو المستمر للجذور ، وكان هذا هو السبب الرئيسي لتطبيق MycoPatt في مراحل النمو. Red fescue هو نبات معمر من أرض عشبية تعامل لفترة طويلة بأسمدة مختلفة. جذورها لها تطور أقصر من 1 سنة ، ويعتبر anthesis كنقطة الغطاء النباتي عندما يغير النبات عملية التمثيل الغذائي من الخضري إلى التوليدية. للقبض على هذه النباتات خلال فترات النشاط المكثف هذه ، تم اختيار النقاط الزمنية المذكورة أعلاه. أخذ العينات خلال فترة الغطاء النباتي أمر صعب بالنسبة لهذا النوع عندما يزرع في الأراضي العشبية الطبيعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدراسات حول الاستعمار الفطري حيوية لتطوير استراتيجية جديدة في المجال الزراعي. إن قدرة النباتات المزروعة المتعددة على تكوين ارتباط تكافلي مع الميكوريزا المفصلية جعلتها مكونا مهما في التنمية المستدامة للنظام الإيكولوجي الزراعي والحفاظ على صحته16،17،<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تستخدم هذه الورقة البيانات الناتجة عن دراستين للدكتوراه في المجال المواضيعي “أنماط الذرة الفطرية المدفوعة بالمدخلات الزراعية” ، التي أجرتها فيكتوريا بوب مولدوفا ، و “حالة الميكوريزال وتطور الاستعمار في الأنواع المهيمنة في الأراضي العشبية الجبلية” ، التي أجرتها لاريسا كوركوز ، بتنسيق من الأستاذة الدكتورة روكسانا فيديكان.
Materials
| Apple vinegar 5% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE MERE | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere |
| Blue Ink | Pelikan | 4001 | https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan |
| Cover slips | Menzel-Glaser | D 263 M | https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser |
| Forceps, PMP | Vitalab | 9.171 411 | http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33 |
| Glass jar 47 mL | Indigo Cards | BORCAN 47 ML HEXAGONAL | https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal |
| Laminating Pouches | Peach | PP525-08 | Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328 |
| Microflow Class II ABS Cabinet | Bioquell UK Ltd | Microflow Class II ABS Cabinet | http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf |
| Microscope slides | Deltalab | D100001 | https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26×76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE |
| Microsoft Office 365 | Microsoft | Office 365 | Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation |
| NaOH | Oltchim | 01-2119457892-27-0065 | http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf |
| Nitrile gloves | SemperGuard | 816780637 | https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE |
| Optika camera | OPTIKA | CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0 | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/ |
| Optika Microscope | OPTIKA | B383pL | https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/ |
| Protective mask FFP3 | Hermes Gift | HERMES000100 | EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section |
| Scalpel | Cutfix | 9409814 | https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809 |
| White wine vinegar 9% | FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L. | OȚET DE VIN ALB | https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb |
References
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).
- Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. 4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems. The Mycota. IX Fungal Associations. , 51-75 (2012).
- Parniske, M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).
- Gianinazzi, S., et al. Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
- Lee, E. -. H., Eo, J. -. K., Ka, K. -. H., Eom, A. -. H. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems. Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).
- Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).
- Shah, A. A., et al. Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum. Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).
- Souza, T. . Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , (2015).
- Sun, X. -. G., Tang, M. Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi. Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).
- Smith, S., Read, D., Smith, S. E., Read, D. J. Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza. Mycorrhizal Symbiosis. , 42-90 (2008).
- Stoian, V., et al. Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots. Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).
- Pop-Moldovan, V., et al. Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment. Plants. 10 (12), 2760 (2021).
- Corcoz, L., et al. Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland. Plants. 11 (1), 112 (2021).
- Corcoz, L., et al. Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra. Agronomy. 12 (3), 650 (2022).
- Stoian, V., Florian, V. Mycorrhiza – Benefits, influence, diagnostic method. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).
- Prates Júnior, P., et al. Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity. PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis. New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).
- Rillig, M. C., et al. Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture. Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).
- Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem. Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
- Vaida, I., Păcurar, F., Rotar, I., Tomoș, L., Stoian, V. Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland. Plants. 10 (4), 739 (2021).
- . The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: https://invam.wvu.edu/collection (2022)
- . The International Bank for the Glomeromycota Available from: https://www.i-beg.eu/ (2022)
