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생물학

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

Published: April 06, 2022
doi:
10.3791/63618
, , , ,
1Department of Entomology,Texas A&M University, 2USDA-ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, 3USDA-ARS Veterinary Pest Research Unit

Summary

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Abstract

진드기는 여러 병원체를 벡터 할 수있는 중요한 외부 기생충입니다. 진드기의 타액선은 타액에 숙주 면역 반응을 감소시키고 병원균 전달을 향상시킬 수있는 제약 특성을 가진 많은 이펙터가 포함되어 있기 때문에 먹이에 필수적입니다. 이러한 이펙터의 한 그룹은 마이크로RNA(miRNAs)이다. miRNAs는 진드기-숙주 계면과 진드기의 기관 내에서 숙주 유전자 발현을 조절하는 짧은 비코딩 서열이다. 이 작은 RNA는 세포 간 및 세포 내 의사 소통을 제공하는 세포 밖 소포 (EVs)를 통해 진드기 타액으로 운반됩니다. miRNA를 포함하는 소포는 진드기의 타액에서 확인되었습니다. 그러나 진드기 타액 소포와 땀샘에서 miRNA의 역할과 프로파일에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 또한, 진드기 타액의 소포와 miRNA에 대한 연구는 진드기 타액을 수집하는 지루한 절차가 필요합니다. 이 프로토콜은 생체외 장기 배양에 의해 생산된 정제된 세포밖 소포로부터 miRNA를 단리하는 방법을 개발하고 검증하는 것을 목표로 한다. 세포밖 소포 및 진드기 타액선으로부터 miRNAs를 추출하는데 필요한 물질 및 방법론이 본원에 기재되어 있다.

Introduction

진드기는 야생 동물, 가축, 인간 및 애완 동물에게 많은 병원균을 벡터하는 외부 기생충입니다 1,2. 진드기 먹이는 가죽에 손상을 입히고, 심한 빈혈로 인한 체중 및 우유 생산을 줄이며, 잠재적으로 치명적인 질병을 일으키는 병원균 1,3,4,5의 전염으로 인해 상당한 경제적 손실을 초래합니다. 진드기 개체군을 관리하기위한 현재의 통제 관행은 살비제의 사용에 초점을 맞추고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 가축5,6을 기생시키는 진드기에서 살비제 내성의 지속적인 출현, 진드기 물린의 발생률 증가7, 주거 지역 내의 병원균 전염 8,9은 독특한 진드기 통제 대안에 대한 필요성을 이끌어 냈다.

진드기 타액선은 진드기의 생물학적 성공을 보장하는 필수 기관입니다. 그들은 다양한 생리 기능을 가진 다른 acinus 유형 (I, II, III 및 IV)에 의해 형성됩니다. 타액선은 타액분비 2,10을 통해 과도한 물과 철분 함량을 숙주에게 돌려줌으로써 숙주 안팎에서 삼투 조절을 담당합니다. 타입 I acini는 또한 흡습성 타액10,11의 분비에 의해 대기로부터 물의 흡수에 관여한다. 타액 이펙터 단백질, 예를 들어 시멘트 및 시스타틴은 유형 II 및 III acini10,12에서 분비 세포 내에서 생산됩니다. 유형 I acini는 진드기 먹이기에 영향을 미치지 않으며, 이는 혈액 식사 섭취가 이러한 acini 유형13,14의 형태 학적 및 생리적 변화를 유발하지 않는다는 것을 나타냅니다. 반면에, Acini 유형 II 및 III는 먹이는 동안 활성화되며 사전 부착 된 활성이 거의 없습니다. 따라서, 먹이는 유형 II acini 내의 분비 세포의 확대 및 생리 활성 화합물의 생산을 촉발시키기 위해 필요하다. III형 아시니는 분비 과립(12) 내의 분비로 인해 먹이는 동안 크기가 감소된다.

타액선은 진드기와 전염 경로에서 병원균 감염 부위이기도합니다. 먹이를주는 동안, 진드기는 혈액 식사10,15,16의 성공적인 완료에 필요한 제약 효과가있는 여러 화합물을 분비합니다. 이들 화합물은 항염증성, 면역억제 및 혈관확장성 특성10,15,17을 갖는다. 최근 연구에 따르면 진드기 타액선에서 유래 한 세포 밖 소포 (EVs)는 이러한 화합물 중 몇 가지를 보유하여 항 염증 및 면역 조절 효과 18,19,20을 유도합니다. “세포밖 소포”는 그들의 크기 및 생물발생에 기초하여 엑소좀 및 마이크로베시클로 분류된 소포를 기술하는데 사용되는 포괄적인 용어이다. 전반적으로, EVs는 크기21에서 ~40 nm-1 μm인 이중층 막을 갖는 지질 블렙이다; 일반적으로 엑소좀은 크기가 40-150 nm 인 반면, 마이크로베시클은 크기가 150 nm-1 μm 사이인21,22,23 사이입니다. 그러나, 크기는 EVs 생물발생 경로(22)를 지시하지 않는다.

엑소좀의 생물발생은 원형질막의 순차적 질도입으로 시작됩니다. 이 질은 다소포체의 형성으로 이어지고 마침내 ESCRT 복합체 또는 스핑고미엘리나제 (sMases)의 작용에 의해 수포막의 변형을 초래합니다.24,25. 엑소좀은 세포 항상성을 유지하기 위해 리소좀 내에 용해되거나 수포 융합을 통해 원형질막으로 빠져나와 세포 구성성분을 수용자 세포(21,24)에 전달할 수 있다. 한편, 마이크로베시클은 플로패스 및 플립어엉덩이의 작용에 의해 형성되고, 원형질막(26)에서 지질의 입체형태를 변화시킨다. EV는 지질, 단백질, 핵산 및 마이크로RNA(miRNAs)21,27,28과 같은 세포내 화물을 위한 수송 시스템 역할을 하는 세포간 통신에 필수적이다. 일단 수송되면, 이들 소포는 수용자 세포의 세포질 내로 그들의 화물을 전달하여, 수용 세포(22,29)에서 표현형 변화를 생성한다. 진드기 먹이에서 세포 밖 소포의 중요성과 숙주 면역 및 상처 치유 반응18,20의 조작으로 인해, 세포 밖 소포 내의화물은 항 진드기 치료제 개발을위한 잠재적 인 목표와 진드기 먹이를 방해하는 독특한 메커니즘을 제시합니다. 여기에는 진드기 타액선 내 miRNAs와 타액선 유래 세포밖 소포가 포함됩니다.

miRNAs는 짧은 비-코딩 서열, ∼18-22 뉴클레오티드 (nt) 길이, 즉 전사 후 mRNA 서열30,31을 조절, 분해, 또는 침묵시킬 수 있다. 전사 동안, pri-miRNAs는 다이서(RNA 폴리머라제 III)에 의해 절단되어 특유의 헤어핀 유사 구조를 형성하고, 프리-miRNA가 된다. pre-miRNA는 Drosha (RNA 폴리머라제 III)에 의해 다시 한번 절단되어 성숙한 miRNA 듀플렉스를 형성한다. 성숙 서열은 mRNA 서열에 상보적인 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 통합되어, 번역 억제 또는 mRNA 분해 28,30,32를 야기한다. 숙주 먹이를 먹는 동안, 진드기 타액 내의 miRNAs는 숙주 유전자 발현을 조절하여 면역 반응을 억제하고 병원체 전달을 강화할 수 있다(33,34,35,36,37). EV 및 miRNA에 대한 광범위한 연구가 존재하지만, 진드기 – 숙주 인터페이스에서 먹이를주는 동안 그들의 역할은 여전히 잘 이해되지 않습니다. 고품질 miRNA의 분리 및 정제를 쉽게 초래할 수 있는 프로토콜을 최적화하는 것은 이러한 주제에 대한 지식을 발전시키는 데 매우 중요합니다.

EV를 분리하기 위해 다수의 옵션이 이용될 수 있는데, 예를 들어 초원심분리, 엑소좀 침전, 중합체 침전, 면역친화성 크로마토그래피, 및 크기-기반 배제 기술(38)이 있다. 그러나 이러한 기술은 엑소좀이나 마이크로베시클을 구별할 수 없다. 따라서, 앞서 언급한 바와 같이, EV는 상이한 샘플로부터 EV를 분리할 때 포괄적인 용어로서 사용된다. 본원에 기재된 실험에서 단리된 소포는 상이한 생물발생 경로로부터 유래된 소포의 혼합물을 나타낸다. 세포밖 소포의 특정 집단의 추가의 정제는 관심 소포 집단39,40에 고유한 마커 (즉, 엑소좀 마커, 종양 마커)에 대한 항체로 코팅된 비드를 사용하는 면역침전에 의해 달성될 수 있다. miRNA는 또한 상이한 상업적으로 이용가능한 분리 키트(7,41,42)를 통해 추출될 수 있다.

이 프로젝트의 목적은 EV를 분리하고 EV와 유당 타액선 모두에서 miRNA를 추출하기 위해 일반적으로 적용되는 방법을 결합한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 생리 활성 화합물의 분비는먹이 12에 의해 활성화되기 때문에, 진드기는 숙주 면역 및 상처 치유 반응을 조작하는 데 중요 할 수있는 miRNA를 확인하기 위해 사료를 허용해야합니다. 본 프로토콜은 2000 틱(43)을 필요로 하는 이전에 기술된 다른 연구들에 비해 EV들 및 그들의 각각의 miRNA들을 분리하기 위해 적은 수의 틱들(20 틱들)을 필요로 한다. 또한, 필로카르핀44로 타액 분비물의 오염을 피하며, 이는 EVs와 그들의 miRNA가 숙주 세포에 미치는 영향을 연구하는 실험에 영향을 미칠 수 있다.

Protocol

모든 동물 실험은 텍사스 A & M 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (AICUC)의 승인 된 동물 사용 프로토콜 (AUP # 2020-0026)에 따라 수행되었습니다. 진드기 종, Ixodes 견갑골증 및 리피세팔루스(Boophilus) 마이크로플러스, 및 42-72일령의 뉴질랜드 수컷 흰 토끼를 본 연구에 사용하였다. I. 견갑골은 질병 통제 센터 (CDC)와 오클라호마 주립 대학에서 병원균이없는 것으로 인증되었습니다…

Representative Results

본 프로토콜은 타액선 및 EV로부터 miRNA를 추출하기 위한 상세한 방법론을 제공한다. 결과에 따르면, 이 프로토콜은 두 개의 상이한 진드기 종, I. 견갑골 및 R. 마이크로플러스의 성인으로부터 miRNA의 단리에 효과적이며, 잠재적으로 다른 진드기 종에서도 사용될 수 있다. EVs 농도(입자/mL)는 NTA 를 통해 측정되었다. R. microplus의 경우, 각 성별 및 수명 단계에는 세 가지 기술…

Discussion

현재의 프로토콜은 타액선 및 EV로부터 miRNA를 추출하기 위한 상세한 방법론을 제공한다. 그러나 중요한 고려 사항이 있으며,이 모든 사항은이 프로토콜의 각 섹션에 대한 노트에 자세히 설명되어 있습니다. 진드기가 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 진드기를 먹이는 동안 캡슐과 메쉬 그물을 고정해야합니다. 캡슐 제제 및 배치는 Koga et al.40에 기재되어 있다. 진드기 해부의 여러…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 텍사스 주 에딘버러에있는 Cattle Fever 진드기 연구소의 지원에 크게 감사드립니다. 마이클 모세, 제이슨 티드웰, 제임스 헬럼스, 세자리오 아가도, 호머 바스케스에게 감사드립니다. 우리는 또한 Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario 및 Stephanie Guzman Valencia의 도움을 프로젝트 전반에 걸쳐 인정하고 싶습니다. 이 원고를 작성하는 동안 텍사스 A & M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group에 도움과 조언을 해주신 것에 감사드립니다. 다음 시약은 BEI Resources, NIAID, NIH에 의한 유통을 위해 질병 통제 및 예방 센터에 의해 제공되었다 : Ixodes 견갑골증 성인 (라이브), NR-42510. 여성 I. 견갑골 진드기는 오클라호마 주립 대학의 진드기 사육 시설에서도 받았다. 이 프로젝트는 Texas A & M University T3 : 변환 보조금을위한 트라이어드와 USDA-ARS가 AOC에 대한 협력 계약 # 58-3094-1-003에 의해 자금을 지원했습니다.

Materials

0.22 µm syringe filter GenClone 25-240
1 µm nylon syringe filter Tisch Scientific 283129028
1 inch black adhesive Amazon B00FQ937NM Capsule
10 mL needeless syringe Exelint 26265
3' and 5' Adapters Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors Fine Science Tools 15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1.1523
70Ti rotor Beckman Coulter 337922
Amphotericin Corning 30-003-CF
Beads Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Bioanalyzer kit Agilent 5067-1513
Centrifuge 5425 Eppendorf
Chloroform Macron UN1888
Cyverse Discovery Enviornment https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope Nikon SMZ745
Double-sideded carpet tape amazon ‎286373
Falcon Tubes, 50 mL VWR 21008-940
Fetal Bovine Serum Gibco FBS-02-0050
fine forceps Excelta 5-S-SE
Foamies, 2 mm Amazon B004M5QGBQ Capsule
Isoflurane Phoenix Pharmaceuticals manfactured 193.33165.3
Ixodes scaplaris CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate MPI 02191476-CF
Microscope slide VWR 10118-596
miRDeep2 https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol Fischer Bioreagents UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate Corning 353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter Pall Corporation OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3 PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) Illumina 20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge Beckman Coulter
Penicillin Thermofischer Scientific ICN19453780
Pippettes Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle Beckman Coulter 355618
Qiagen miRNeasy kit Qiagen 217084
QIAzol lysis reagent Qiagen 79306
Qubit Thermofisher Q32880
Qubit kit Thermofisher Q10212
Rabbits Charles River
Reverse Universal Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin Fischer Bioreagents 215544
RNAlater Invitrogen 833280
RNAse free tubes VWR 87003294
RNAse inhibitor Thermo Fischer 11111729
RNAse/DNAse free water Qiagen 217084
RNeasy Minelute spin column Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer Illumina 20024906 NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer Qiagen 217084 Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-25G
Sorvall ST16 Thermo Fischer 75004380
Sterilized Gauze sponges Covidien 2187
Sterilized PBS Sigma RNBK0694
streptomycin thermofischer Scientific 15240062
TapeStation Aligent G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive Amazon 7.42836E+11 Capsule
Tissue Adhesive 3M VetBond
Triple Antibiotics dechra 17033-122-75
Tryptose phosphate broth BD BD 260300
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Leal-Galvan, B., Harvey, C., Thomas, D., Saelao, P., Oliva Chavez, A. S. Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (182), e63618, doi:10.3791/63618 (2022).
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