En este manuscrito, demostramos la preparación de una biotinta de hidrogel biohíbrida que contiene grafeno para su uso en ingeniería de tejidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, se realiza el protocolo de diferenciación neural de las células madre. Este puede ser un paso importante para traer biomateriales similares a la clínica.
Las neuropatías periféricas pueden ocurrir como resultado del daño axonal, y ocasionalmente debido a enfermedades desmielinizantes. El daño a los nervios periféricos es un problema global que ocurre en el 1.5% -5% de los pacientes de emergencia y puede conducir a pérdidas significativas de empleos. Hoy en día, los enfoques basados en la ingeniería de tejidos, que consisten en andamios, líneas celulares apropiadas y bioseñales, se han vuelto más aplicables con el desarrollo de tecnologías de bioimpresión tridimensional (3D). La combinación de varios biomateriales de hidrogel con células madre, exosomas o moléculas de bioseñalización se estudia con frecuencia para superar los problemas existentes en la regeneración de nervios periféricos. En consecuencia, la producción de sistemas inyectables, como hidrogeles, o estructuras de conductos implantables formados por diversos métodos de bioimpresión ha ganado importancia en la neuroingeniería periférica. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas no son células especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a una lesión. El sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. En las lesiones de los nervios periféricos, especialmente en la neurotmesis, este microambiente no se puede rescatar por completo incluso después de unir quirúrgicamente las terminaciones nerviosas cortadas. El enfoque de biomateriales compuestos y terapias celulares combinadas aumenta la funcionalidad y aplicabilidad de los materiales en términos de diversas propiedades, como la biodegradabilidad, la biocompatibilidad y la procesabilidad. En consecuencia, este estudio tiene como objetivo demostrar la preparación y el uso de patrones de hidrogel biohíbridos basados en grafeno y examinar la eficiencia de diferenciación de las células madre en células nerviosas, que pueden ser una solución efectiva en la regeneración nerviosa.
El sistema nervioso, que es el mecanismo que une la estructura interna del organismo y el medio ambiente, se divide en dos partes: el sistema nervioso central y periférico. El daño a los nervios periféricos es un problema global que constituye el 1,5%-5% de los pacientes que acuden al servicio de urgencias y se desarrolla debido a diversos traumatismos, lo que lleva a una pérdida significativa del empleo 1,2,3.
Hoy en día, los enfoques celulares de la neuroingeniería periférica son de gran interés. Las células madre ocupan el primer lugar entre las células utilizadas en estos enfoques. En condiciones normales, las células madre son las células regenerativas del cuerpo, y su número y funciones no disminuyen con el tiempo para proteger a sus poblaciones; Estas células son especializadas, pero pueden diferenciarse con la estimulación adecuada en respuesta a la lesión 4,5. Según la hipótesis de las células madre, el sistema de células madre está bajo la influencia de su microambiente, llamado nicho de células madre. La preservación y diferenciación de las células madre es imposible sin la presencia de su microambiente6, que puede ser reconstituido a través de la ingeniería tisular utilizando células y andamios7. La ingeniería de tejidos es un campo multidisciplinario que incluye principios de ingeniería y biología. La ingeniería de tejidos proporciona herramientas para la creación de tejidos artificiales que pueden reemplazar los tejidos vivos y pueden ser utilizados en la regeneración de estos tejidos mediante la eliminación de los tejidos dañados y la provisión de tejidos funcionales8. Los andamios de tejidos, una de las tres piedras angulares de la ingeniería de tejidos, se producen utilizando métodos diferentes de materiales naturales y sintéticos9. La impresión tridimensional (3D) es una tecnología emergente de fabricación aditiva que se utiliza ampliamente para reemplazar o restaurar tejidos defectuosos a través de su producción simple pero versátil de formas complejas utilizando varios métodos. La bioimpresión es un método de fabricación aditiva que permite la coexistencia de células y biomateriales, llamados biotintas10. Teniendo en cuenta la interacción de las células nerviosas entre sí, los estudios se han desplazado a candidatos a biomateriales conductores como el grafeno. Las nanoplacas de grafeno, que tienen propiedades tales como electrónica flexible, supercondensadores, baterías, óptica, sensores electroquímicos y almacenamiento de energía, son un biomaterial preferido en el campo de la ingeniería de tejidos11. El grafeno ha sido utilizado en estudios donde se realizó la proliferación y regeneración de tejidos y órganos dañados12,13.
La ingeniería de tejidos consta de tres bloques de construcción básicos: andamio, células y moléculas de bioseñal. Existen deficiencias en los estudios sobre el daño a los nervios periféricos en términos de proporcionar estas tres estructuras por completo. Se han encontrado varios problemas en los biomateriales producidos y utilizados en los estudios, como que contienen solo células madre o moléculas de bioseñal, la falta de una molécula bioactiva que permita la diferenciación de células madre, la falta de biocompatibilidad del biomaterial utilizado y el bajo efecto sobre la proliferación de células en el nicho tisular. y, por lo tanto, la conducción nerviosa no se realiza completamente 2,13,14,15,16. Esto requiere la optimización de la regeneración nerviosa, reduciendo la atrofia muscular17,18, y creando el homing necesario 19 con factores de crecimiento contra tales problemas. En este punto, la caracterización y el análisis de la neuroactividad de un prototipo de biomaterial quirúrgico, para ser transferido a la clínica, son muy importantes.
En consecuencia, este estudio de métodos investiga el patrón de hidrogel de biotinta con nanoplacas de grafeno formadas por una bioimpresora 3D y su efectividad en la diferenciación neurogénica de las células madre que contiene. Además, se investigan los efectos del grafeno en la formación y diferenciación de la neuroesfera.
Las ventajas de los tratamientos aplicados con andamios 3D diseñados sobre los métodos 2D convencionales son cada vez más notables cada día. Las células madre utilizadas solas en estas terapias o junto con andamios producidos a partir de diversos biomateriales con baja biocompatibilidad y biodegradabilidad suelen ser inadecuadas en la regeneración de los nervios periféricos. Las células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJ-MSCs) parecen ser una línea celular candidata adecuada, especialmente consideran…
The authors have nothing to disclose.
El grafeno utilizado en este estudio fue desarrollado en la Universidad de Kirklareli, Departamento de Ingeniería Mecánica. Fue donado por el Dr. Karabeyoğlu. La prueba de toxicidad del grafeno fue financiada por el proyecto titulado “Impresión y diferenciación de células madre mesenquimales en bioimpresoras 3D con biotintas dopadas con grafeno” (Nº de solicitud: 1139B411802273) completado dentro del alcance del Programa de Apoyo a la Tesis de Pregrado TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis. La otra parte del estudio fue apoyada por el fondo de investigación proporcionado por los Proyectos de Investigación Científica de la Universidad Técnica de Yildiz (TSA-2021-4713). Las células madre mesenquimales con GFP utilizadas en la etapa de imagen de lapso de tiempo fueron donadas por Virostem Biotechnology. Los autores agradecen a Darıcı LAB y al equipo de YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB por sus discusiones productivas.
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |