ניתוח הדינמיקה של מיקרוביוטה בצואה בעכברים המועדים לזאבת באמצעות שיטת בידוד דנ"א פשוטה וחסכונית
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד דנ”א פשוטה וחסכונית לניתוח שינויים במיקרוביוטה של מורין במעיים במהלך התפתחות מחלות אוטואימוניות.
Abstract
למיקרוביוטה של המעיים יש תפקיד חשוב בחינוך מערכת החיסון. קשר זה חשוב ביותר להבנת מחלות אוטואימוניות שאינן מונעות רק על ידי גורמים גנטיים, אלא גם גורמים סביבתיים שיכולים לעורר את הופעת המחלה ו/או להחמיר אותה. מחקר שפורסם בעבר על הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים אצל נקבות MRL/lpr המועדות לזאבת הראה כיצד שינויים במיקרוביוטה של המעיים יכולים לשנות את התקדמות המחלה. כאן מתואר פרוטוקול לחילוץ דגימות מייצגות מהמיקרוביוטה של המעיים למחקרים על אוטואימוניות. דגימות מיקרוביוטה נאספות מפי הטבעת ומעובדות, מהן מופק הדנ”א בשיטת פנול-כלורופורם ומטוהר על ידי משקעי אלכוהול. לאחר ביצוע PCR, אמפליקונים מטוהרים מרוצפים באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא במעבדה הלאומית ארגון. לבסוף, נתוני ריצוף הגנים של RNA ריבוזומלי 16S מנותחים. לדוגמה, מוצגים נתונים שהתקבלו מהשוואות מיקרוביוטה של המעיים של עכברי MRL/lpr עם או בלי CX3CR1. התוצאות הראו הבדלים משמעותיים בסוגים המכילים חיידקים פתוגניים כמו אלה שבגוף הפרוטאובקטריה, כמו גם בסוג ביפידובקטריום, שנחשב לחלק מהמיקרוביוטה הבריאה. לסיכום, שיטת בידוד הדנ”א הפשוטה והחסכונית הזו אמינה ויכולה לסייע בחקר שינויים במיקרוביוטה של המעיים הקשורים למחלות אוטואימוניות.
Introduction
בני אדם וחיידקים התקיימו בדו-קיום במשך זמן רב. הם יצרו מערכת יחסים של תלות הדדית עם השפעות מועילות הדדיות המשפיעות על תגובות החיסון של המארח בדרכים כמותיות ואיכותיות1. מחקרים אחרונים מצביעים על קשר בין הרכב המיקרוביוטה של המעיים לבין הפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות הכוללות טרשת נפוצה 2, דלקת מפרקים שגרונית3, סוכרת מסוג2 4, מחלות מעי דלקתיות5 וזאבת אדמנתית מערכתית (SLE)6. עם זאת,עדיין לא ברור אם המיקרוביוטה של המעיים היא הגורם העיקרי או ההשפעה המשנית של המחלות האוטואימוניות הללו. באופן פוטנציאלי, מיקרוביוטה של המעיים עלולה להחמיר את המחלה במהלך שלב ההשפעה של הפרעות אוטואימוניות או למלא תפקיד בוויסות האינדוקציה של מחלות אלה8.
דווח על דיסביוזיס במעיים אצל נקבות הנוטות לזאבת MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr),ונצפו שינויים במיקרוביוטה של המעיים עם דלדול משמעותי של לקטובצילי 9. כאשר תערובת של חמישה זני לקטובצילוס ניתנה דרך הפה, תסמינים דמויי זאבת נחלשו במידה רבה בעכברים אלה, מה שמרמז על תפקיד חיוני של מיקרוביוטה בוויסות פתוגנזה של SLE.
הטכניקה הבאה של מיצוי DNA מאפשרת לעקוב אחר תנודות מיקרוביוטה ולנתח אותם איכותית וכמותית במהלך מחלת מורין SLE בעכברים נוטים זאבת. בין אם לבחון את המיקרוביוטה הבריאה של המעיים או להגדיר דיסביוזיס, חשוב לבחון באופן ביקורתי כיצד הנתונים נאספים והאם הם מדויקים וניתנים לשחזור10. כל שלב הוא קריטי בתהליך זה. יש להשתמש במתודולוגיה מתאימה כדי לחלץ דנ”א מיקרוביאלי, שכן כל בעיה אפשרית בהטיות במהלך תהליך מיצוי הדנ”א עלולה לגרום לייצוג מיקרוביאלי לא מדויק. בעוד ששיטת הפנול-כלורופורם מתוארת כאן, ישנן ערכות זמינות מסחרית לחילוץ דנ”א מחיידקים שעובדות היטב במקרים מסוימים11. עם זאת, השימושיות שלהם מוגבלת על ידי העלות וכמות המדגם הנדרשת.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא חסכוני ודורש רק כמות קטנה של דגימה. הוא עובד מצוין עם כל סוג של דגימת צואה, והוא שימושי בחקר הדינמיקה של המיקרוביוטה של המעיים לאורך זמן, כמו גם בהשוואות בין קבוצות. הדנ”א מבודד בשיטה של טיהור אלכוהול, המשתמשת בפנול, כלורופורם ואלכוהול איזואמיל. מיצוי על בסיס אלכוהול מסייע לנקות ולהסיר את הדגימה של חלבונים ושומנים, שם DNA הוא זירז בשלב האחרון. השיטה המוצעת היא בעלת יעילות ואיכות גבוהות משמעותית והוכחה כמדויקת בזיהוי אוכלוסיות חיידקים. הערה קריטית אחת במהלך ההליך היא שזיהום DNA יכול להתרחש, ולכן נדרש טיפול מתאים בדגימה12.
לאחר מכן, הדנ”א מנותח על ידי פלטפורמות הריצוף של הדור הבא עבור הגן 16S rRNA, כגון Illumina MiSeq. בפרט, אזור ההיפר-משתנה V4 מנותח כדי לספק כימות טוב יותר עבור טקסהבדרגה גבוהה 13. ניתוח הביואינפורמטיקה שלאחר מכן הוא במיקור חוץ, ואחריו ניתוח פנימי בשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות. ישנן תוכנות ביואינפורמטיקה רבות בקוד פתוח הזמינות לריצוף במורד הזרם, וסוג הניתוחים המבוצעים תלוי במידה רבה בשאלה הביולוגית הספציפית המעניינת14. פרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי בשלבי הניסוי לפני הריצוף ומספק שיטה רב-תכליתית, חסכונית, דומה ויעילה יותר להשגת דנ”א מדגימות צואה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוביוטה מאוזנת של המעיים יכולה להגן על גוף האדם מפני מחלות. ברגע שאיזון זה מופר על ידי טריגרים חיצוניים או פנימיים, התוצאות יכולות להיות הרסניות. שיטה זו מציגה דרך לנתח את הדינמיקה של מיקרוביוטה של המעיים במודלים של מורין. השיטה מתאימה לא רק להשוואות בין קבוצות, אלא גם למעקב אחר המיקרוב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים את העזרה מהמעבדה הלאומית של ארגון ומהביואינפורמטיקאים המשתפים פעולה שלנו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.
Materials
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota – effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B. Tools for analysis of the microbiome. Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
