formulere og karakterisere et eksosombasert dopaminbærersystem

Summary

Her hadde vi som mål å oppnå en formulering ved dopaminbelastning av de isolerte eksosomene av stamceller fra Whartons gelémesenkymale stamceller. Eksosomisolering og karakterisering, legemiddelbelastning i de resulterende eksosomene og den cytotoksiske aktiviteten til den utviklede formuleringen er beskrevet i denne protokollen.

Abstract

Eksosomer mellom 40 og 200 nm i størrelse utgjør den minste undergruppen av ekstracellulære vesikler. Disse bioaktive vesiklene utskilt av celler spiller en aktiv rolle i intercellulær last og kommunikasjon. Exosomer finnes for det meste i kroppsvæsker som plasma, cerebrospinalvæske, urin, spytt, fostervann, råmelk, morsmelk, leddvæske, sæd og pleurasyre. Tatt i betraktning størrelsen på eksosomer, antas det at de kan spille en viktig rolle i sykdommer i sentralnervesystemet fordi de kan passere gjennom blod-hjernebarrieren (BBB). Derfor har denne studien som mål å utvikle et eksosombasert nanobærersystem ved å innkapsle dopamin i eksosomer isolert fra Whartons gelé mesenkymale stamceller (WJ-MSCs). Exosomer som passerte karakteriseringsprosessen ble inkubert med dopamin. De dopaminbelastede eksosomene ble rekarakterisert ved slutten av inkubasjonen. Dopaminbelastede eksosomer ble undersøkt i medikamentfrigivelses- og cytotoksisitetstester. Resultatene viste at dopamin kunne bli vellykket innkapslet i eksosomene, og at de dopaminbelastede eksosomene ikke påvirket fibroblastens levedyktighet.

Introduction

Exosomer, bioaktive vesikler med betydelige egenskaper, varierer i størrelse fra 40 nm til 200 nm. Exosomer stammer fra cellemembranen og dannes på grunn av frigjøring av endosomene¹. Disse strukturene tjener som celle-til-celle-kommunikatorer og interagerer med naboceller for å lette overføringen av aktive molekyler. Exosomer kan isoleres fra mange forskjellige kilder. Disse inkluderer kroppsvæsker som plasma, urin, cerebrospinalvæske, spytt, samt cellelinjer dyrket under in vitro-forhold . Eksosomer har en viktig rolle i eliminering av nerveskader, takket være biomakromolekylene de inneholder, som lipider, proteiner og nukleinsyrer². Glia, som er støttecellene i nervesystemet³, overfører proteiner og mikro-RNA til aksonene til nevroner via eksosomer⁴.

Lipider som danner myelinskjeden, som er et karakteristisk trekk ved nerveledning, frigjøres også fra oligodendrocytter via eksosomer ^4,5. Exosomer er også involvert i prosesser som synaptisk plastisitet, neuronal stressrespons, celle-cellekommunikasjon og neurogenese i hjernen ^6,7. Det faktum at eksosomer har nano-dimensjoner gjør at de kan passere gjennom BBB. Det er en spesiell overgangsrute fra interstitialvæsken til cerebrospinalvæsken etter penetrering av denne membranen⁸. Takket være overflateegenskapene kan eksosomer samhandle effektivt med målceller som et legemiddelleveringssystem og aktivt levere de lastede legemidlene.

På grunn av ekspresjonen av forskjellige klebende proteiner (tetraspaniner og integriner) på overflaten av eksosomer, kan disse ekstracellulære vesiklene lett samhandle og smelte sammen med vertscellemembraner⁹. Det antas at eksosomer kan brukes som et legemiddelleveringssystem, spesielt ved behandling av sykdommer i sentralnervesystemet på grunn av deres evne til å trenge inn i BBB og deres overflateegenskaper. Mesenkymale stamcelle (MSC)-avledede eksosomer har lavere risiko for immunavstøtning sammenlignet med allogene cellulære terapier, og i denne forbindelse kan de være en viktig komponent i cellefrie behandlingsapplikasjoner¹⁰.

Dopamin er et molekyl hvis mangel i hjernen er det karakteristiske trekk ved Parkinsons sykdom (PD), forverres dag^{for dag 11,12,13}. Det er kjent at PD er assosiert med degenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra av mesencephalon og tap av motorneuronfunksjoner^14,15. Døden av dopaminerge nevroner forhindrer tilførsel av nevrotransmitteren dopamin til hjernens striatum. Dette resulterer igjen i fremveksten av PD-spesifikke symptomer¹⁶. Disse symptomene på PD er bradykinesi, postural ustabilitet, stivhet og spesielt hviletremor^12,13. Selv om PD først ble beskrevet for mer enn to århundrer siden, pågår studier for å forstå sykdommens patologi og etiologi fortsatt, og det er for tiden akseptert at PD er en kompleks systemisk sykdom¹⁷. Det er spådd at dopaminmangel oppstår, og kliniske PD-symptomer observeres når mer enn 80% av nevronene degenererer¹⁸. Ved behandling av sykdommen foretrekkes ufullstendig dopamintilskudd for å redusere motoriske symptomer. In vivo studier har vist at direkte infusjon av dopamin i hjernen signifikant reduserer symptomer hos dyr¹⁹. Dopaminforløpere som L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenylalanin) og dopaminreseptormedikamenter brukes i klinikken fordi direkte infusjon av dopamin i hjernen ikke er mulig hos mennesker og dopamin som kommer inn i systemet ikke kan krysse BBB²⁰. Disse typer stoffer mister sin effektivitet over tid. Imidlertid er det fortsatt ingen kurativ behandlingstilnærming for PD. Derfor er det et stort behov for å utvikle nye terapeutiske strategier og behandlingsmodaliteter for å avsløre patofysiologien til sykdommen og redusere virkningen av PD på pasienter.

Eksosombaserte studier har nylig fått oppmerksomhet for å samle informasjon om både terapeutiske tilnærminger og patologier av sykdommer i nervesystemet. MSC-avledede eksosomer har vist seg å redusere betennelse i nerveskader og bidra til nevronregenerering^21,22,23. I tillegg har det blitt rapportert at MSC-avledede eksosomsekretamer reduserer apoptose ved å vise nevrotrofiske og nevrobeskyttende effekter, spesielt på dopaminerge nevroner^24,25. Forskning på plattformer der eksosomer brukes som terapeutiske legemiddelleveringssystemer har intensivt akselerert de siste årene. I mange studier har det blitt observert at relevante legemidler lett kan innkapsles i eksosomer og leveres trygt inn i målceller, vev og organer^26,27. Ulike metoder som inkubasjon, fryse / tine sykluser, sonikering og ekstrudering kan brukes til legemiddelbelastning i eksosomer²⁸.

Coincubation med eksosomer eller eksosomlignende vesikler gjør at lipofile små molekyler kan passivt innkapsles i disse leveringssystemene^28,29,30. Spesielt ble forskjellige molekyler som curcumin 31, katalase 30, doksorubicin³² og paklitaksel³³ effektivt lastet inn i eksosomer. Det har blitt observert at katalaseholdige eksosomer, som har antioksidantaktivitet, effektivt akkumuleres i nevronene og mikroglialcellene i hjernen og viste sterke nevrobeskyttende aktiviteter³⁰. I den samme studien, saponin, lagt inn i komplekset for å øke belastningseffektiviteten, ble funnet å øke stoffbelastningsprosenten under inkubasjon^30,34. Imidlertid er det behov for ytterligere studier for å etablere standarder for legemiddelbelastning i eksosomer.

Denne artikkelen beskriver utviklingen av et nanobærersystem ved innkapsling av dopamin i eksosomer som ble isolert fra WJ-MSC. Alle trinn, inkludert dyrking av WJ-MSC, isolering og karakterisering av eksosomer, legemiddelbelastningseksperimenter, karakterisering av dopaminbelastede eksosomer med forskjellige teknikker og in vitro cytotoksisitetsanalyse er forklart i detalj.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen. 1. Dyrking og kryopreservering av Whartons gelé mesenkymale stamceller Fjern WJ-MSC (fra ATCC) fra fryseren ved -80 °C. Frø cellene til en kolbe som inneholder DMEM-F12 medium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS). Inkuber dem ved 37 ° C i en inkubator som inneholder 5% CO2. Endre kulturmediet hver 2. Pass ce…

Representative Results

Eksosomisolasjon og karakteriseringWharton gelé stamceller dyrkes og inkuberes i et serumfritt medium i 48 timer når kulturen når tilstrekkelig tetthet. Etter endt inkubasjon lagres supernatanten ved -20 °C. De innsamlede supernatantene fortynnes med PBS og utsettes for ultrasentrifugering (figur 1). Den oppnådde løsningen analyseres ved NTA- og DLS-analyser. Eksosomene steriliseres ved å passere gjennom et 0, 22 μm filter. Den gjennomsnittlige størrelsen på d…

Discussion

Eksosomer er små membranvesikler med dimensjoner på 40-200 nm som skilles ut av de fleste celletyper, for eksempel MSC¹. I stand til å muliggjøre kommunikasjon mellom celler, kan eksosomer komme inn i celler på forskjellige måter som endocytose, fagocytose, mikropinocytose, lipidmediert internalisering og fusjon ^33,44. Sammenlignet med andre nanobærersystemer, gir lipidene og kolesterolet som finnes på eksosomoverflaten evnen til ?…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization