Formulering och karakterisering av ett exosombaserat dopaminbärarsystem

Summary

Här syftade vi till att erhålla en formulering genom dopaminladdning av de isolerade exosomerna av stamceller från Whartons gelémesenkymala stamceller. Exosomisolering och karakterisering, läkemedelsladdning i de resulterande exosomerna och den cytotoxiska aktiviteten hos den utvecklade formuleringen beskrivs i detta protokoll.

Abstract

Exosomer mellan 40 och 200 nm i storlek utgör den minsta undergruppen av extracellulära vesiklar. Dessa bioaktiva vesiklar som utsöndras av celler spelar en aktiv roll i intercellulär last och kommunikation. Exosomer finns främst i kroppsvätskor som plasma, cerebrospinalvätska, urin, saliv, fostervatten, råmjölk, bröstmjölk, ledvätska, sperma och pleurasyra. Med tanke på exosomernas storlek tror man att de kan spela en viktig roll vid sjukdomar i centrala nervsystemet eftersom de kan passera genom blod-hjärnbarriären (BBB). Därför syftade denna studie till att utveckla ett exosombaserat nanobärarsystem genom att kapsla in dopamin i exosomer isolerade från Whartons gelémesenkymala stamceller (WJ-MSC). Exosomer som klarade karakteriseringsprocessen inkuberades med dopamin. De dopaminladdade exosomerna omkarakteriserades i slutet av inkubationen. Dopaminladdade exosomer undersöktes i läkemedelsfrisättnings- och cytotoxicitetsanalyser. Resultaten visade att dopamin framgångsrikt kunde kapslas in i exosomerna och att de dopaminladdade exosomerna inte påverkade fibroblasternas viabilitet.

Introduction

Exosomer, bioaktiva vesiklar med betydande egenskaper, varierar i storlek från 40 nm till 200 nm. Exosomer härstammar från cellmembranet och bildas på grund av frisättningen av endosomerna¹. Dessa strukturer fungerar som cell-till-cell-kommunikatörer och interagerar med närliggande celler för att underlätta överföringen av aktiva molekyler. Exosomer kan isoleras från många olika källor. Dessa inkluderar kroppsvätskor som plasma, urin, cerebrospinalvätska, saliv samt cellinjer odlade under in vitro-förhållanden . Exosomer har en viktig roll i elimineringen av nervskador, tack vare de biomakromolekyler de innehåller, såsom lipider, proteiner och nukleinsyror². Glia, som är stödcellerna i nervsystemet³, överför proteiner och mikro-RNA till nervcellernas axoner via exosomer⁴.

Lipider som bildar myelinskidan, som är ett karakteristiskt drag i nervledning, frisätts också från oligodendrocyter via exosomer ^4,5. Exosomer är också involverade i processer som synaptisk plasticitet, neuronal stressrespons, cell-cell-kommunikation och neurogenes i hjärnan ^6,7. Det faktum att exosomer har nanodimensioner gör det möjligt för dem att passera genom BBB. Det finns en speciell övergångsväg från interstitialvätskan till cerebrospinalvätskan efter att ha penetrerat detta membran⁸. Tack vare sina ytegenskaper kan exosomer interagera effektivt med målceller som ett system för läkemedelstillförsel och aktivt leverera de laddade läkemedlen.

På grund av uttrycket av olika vidhäftande proteiner (tetraspaniner och integriner) på exosomernas yta kan dessa extracellulära vesiklar lätt interagera och smälta samman med värdcellmembran⁹. Man tror att exosomer kan användas som ett system för läkemedelstillförsel, särskilt vid behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet på grund av deras förmåga att tränga igenom BBB och deras ytegenskaper. Mesenkymala stamceller (MSC)-härledda exosomer har en lägre risk för immunavstötning jämfört med allogena cellterapier, och i detta avseende kan de vara en viktig komponent i cellfria behandlingsapplikationer¹⁰.

Dopamin är en molekyl vars brist i hjärnan är det karakteristiska kännetecknet för Parkinsons sjukdom (PD), som förvärras dag för dag^11,12,13. Det är känt att PD är associerat med degeneration av dopaminerga neuroner i substantia nigra av mesencephalon och förlust av motorneuronfunktioner^14,15. Döden av dopaminerga nervceller förhindrar tillförseln av signalsubstansen dopamin till hjärnans striatum. Detta resulterar i sin tur i uppkomsten av PD-specifika symtom¹⁶. Dessa symtom på PD är bradykinesi, postural instabilitet, stelhet och särskilt vilotremor^12,13. Även om PD först beskrevs för mer än två århundraden sedan, pågår fortfarande studier för att förstå sjukdomens patologi och etiologi och det är för närvarande accepterat att PD är en komplex systemisk sjukdom¹⁷. Det förutspås att dopaminbrist uppstår, och kliniska PD-symtom observeras när mer än 80 % av neuronerna degenererar¹⁸. Vid behandling av sjukdomen är ofullständigt dopamintillskott att föredra för att minska motoriska symtom. In vivo-studier har visat att direkt infusion av dopamin i hjärnan avsevärt minskar symtomen hos djur¹⁹. Dopaminprekursorer som L-DOPA (L-3,4-dihydroxifenylalanin) och dopaminreceptorläkemedel används i kliniken eftersom den direkta infusionen av dopamin i hjärnan inte är möjlig hos människor och dopamin som kommer in i systemet inte kan passera BBB²⁰. Dessa typer av läkemedel förlorar sin effektivitet med tiden. Det finns dock fortfarande ingen botande behandlingsmetod för Parkinsons sjukdom. Därför finns det ett stort behov av att utveckla nya terapeutiska strategier och behandlingsmetoder för att avslöja sjukdomens patofysiologi och minska effekterna av PD på patienter.

Exosombaserade studier har nyligen uppmärksammats för att samla in information om både terapeutiska metoder och patologier för sjukdomar i nervsystemet. MSC-härledda exosomer har visat sig minska inflammation i nervskador och bidra till neuronal regenerering^21,22,23. Dessutom har det rapporterats att MSC-härledda exosomsekretomer minskar apoptos genom att visa neurotrofiska och neuroprotektiva effekter, särskilt på dopaminerga neuroner^24,25. Forskningen om plattformar där exosomer används som terapeutiska system för läkemedelstillförsel har accelererat intensivt de senaste åren. I många studier har det observerats att relevanta läkemedel lätt kan kapslas in i exosomer och levereras säkert till målceller, vävnader och organ^26,27. Olika metoder såsom inkubation, frysning/upptining cykler, ultraljudsbehandling och extrudering kan användas för läkemedelsladdning i exosomer²⁸.

Sammanföring med exosomer eller exosomliknande vesiklar gör det möjligt för lipofila små molekyler att passivt kapslas in i dessa leveranssystem^28,29,30. I synnerhet laddades olika molekyler som curcumin³¹, katalas 30, doxorubicin 32 och paklitaxel³³ effektivt in i exosomer. Det har observerats att exosomer som innehåller katalas, som har antioxidantaktivitet, effektivt ackumulerades i neuroner och mikrogliaceller i hjärnan och uppvisade starka neuroprotektiva aktiviteter³⁰. I samma studie visade det sig att saponin, som tillsattes i komplexet för att öka laddningseffektiviteten, ökade läkemedelsladdningsprocenten under inkubation^30,34. Ytterligare studier behövs dock för att fastställa standarderna för läkemedelsladdning i exosomer.

Denna artikel beskriver utvecklingen av ett nanobärarsystem genom inkapsling av dopamin i exosomer som isolerades från WJ-MSC. Alla steg, inklusive odling av WJ-MSCs, isolering och karakterisering av exosomer, läkemedelsladdningsexperiment, karakterisering av dopaminladdade exosomer med olika tekniker och in vitro cytotoxicitetsanalys förklaras i detalj.

Protocol

OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och utrustning som används i detta protokoll. 1. Odling och kryokonservering av Whartons gelémesenkymala stamceller Ta bort WJ-MSC (från ATCC) från frysen -80 °C. Frö cellerna i en kolv som innehåller DMEM-F12 medium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS). Inkubera dem vid 37 °C i en inkubator som innehåller 5 % CO2 . Byt odlingsmedium varannan…

Representative Results

Exosomisolering och karakteriseringWharton geléstamceller odlas och inkuberas i ett serumfritt medium i 48 timmar när kulturen når tillräcklig densitet. Efter inkubationens slut förvaras supernatanten vid -20 °C. De uppsamlade supernatanterna späds med PBS och genomgår ultracentrifugering (figur 1). Den erhållna lösningen analyseras med NTA- och DLS-analyser. Exosomerna steriliseras genom att passera genom ett 0,22 μm filter. Den genomsnittliga storleken på …

Discussion

Exosomer är små membranvesiklar med dimensioner på 40-200 nm som utsöndras av de flesta celltyper, t.ex. MSC¹. Exosomer kan möjliggöra kommunikation mellan celler och kan komma in i celler på olika sätt såsom endocytos, fagocytos, mikropinocytos, lipidmedierad internalisering och fusion^33,44. Jämfört med andra nanobärarsystem ger lipiderna och kolesterolet som finns på exosomens yta förmågan att bära både hydrofila och hyd…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization