Análisis cuantitativo de las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos mediante pinzas ópticas y microscopía desenfocada
Summary
Aquí, se describe un protocolo integrado basado en pinzas ópticas y microscopía desenfocada para medir las propiedades reológicas de las células. Este protocolo tiene una amplia aplicabilidad en el estudio de las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos en condiciones fisiopatológicas variables.
Abstract
Las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos han sido investigadas por una variedad de técnicas. Sin embargo, los datos experimentales reportados varían. Esto no solo se atribuye a la variabilidad normal de las células, sino también a las diferencias en los métodos y modelos de respuesta celular. Aquí, se emplea un protocolo integrado que utiliza pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para obtener las características reológicas de los glóbulos rojos en el rango de frecuencia de 1 Hz a 35 Hz. Mientras que las pinzas ópticas se utilizan para medir la constante elástica del complejo eritrocitario, la microscopía de desenfoque es capaz de obtener el perfil de altura de la célula, el volumen y su factor de forma, un parámetro que permite la conversión de la constante elástica compleja en módulo de corte complejo. Además, aplicando un modelo de reología vítrea suave, se puede obtener el exponente de escala para ambos módulos. La metodología desarrollada permite explorar el comportamiento mecánico de los glóbulos rojos, caracterizando sus parámetros viscoelásticos, obtenidos bajo condiciones experimentales bien definidas, para varias condiciones fisiológicas y patológicas.
Introduction
Los glóbulos rojos maduros (RBC), también conocidos como eritrocitos, pueden extenderse más del doble de su tamaño cuando pasan a través de los capilares más estrechos del cuerpo humano1. Tal capacidad se atribuye a su capacidad única de deformarse cuando se somete a cargas externas.
En los últimos años, diferentes estudios han caracterizado esta característica en superficies de glóbulos rojos 2,3. El área de la física que describe las respuestas elásticas y viscosas de los materiales debido a las cargas externas se llama reología. En general, cuando se aplica una fuerza externa, la deformación resultante depende de las propiedades del material y se puede dividir en deformaciones elásticas, que almacenan energía, o deformaciones viscosas, que disipan la energía4. Todas las células, incluidos los glóbulos rojos, exhiben un comportamiento viscoelástico; En otras palabras, la energía se almacena y se disipa. La respuesta viscoelástica de una célula puede caracterizarse por su módulo de cizallamiento complejo G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω), donde G‘ (ω) es el módulo de almacenamiento, relacionado con el comportamiento elástico, y G“ (ω) es el módulo de pérdida, relacionado con su viscosidad4. Además, se han utilizado modelos fenomenológicos para describir las respuestas celulares, uno de los más utilizados se denomina modelo5 de reología vítrea blanda, caracterizado por una dependencia de la ley de potencia del módulo de cizallamiento complejo con la frecuencia de carga.
Se han empleado métodos basados en una sola célula para caracterizar las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos, aplicando fuerza y midiendo el desplazamiento en función de la carga impuesta 2,3. Sin embargo, para el módulo de cizallamiento complejo, se pueden encontrar pocos resultados en la literatura. Utilizando la dispersión dinámica de la luz, se informaron valores para el almacenamiento de RBC y los módulos de pérdida que variaron de 0.01-1 Pa, en el rango de frecuencia de 1-100 Hz6. Mediante el uso de citometría óptica de torsión magnética, se obtuvo un módulo elástico complejo aparente7, y para fines de comparación, se afirmó un factor multiplicativo para posiblemente aclarar las discrepancias.
Más recientemente, se estableció una nueva metodología basada en pinzas ópticas (OT) junto con microscopía desenfocada (DM), como herramienta integrada para mapear cuantitativamente el almacenamiento y la pérdida de módulos de cizallamiento de eritrocitos humanos sobre cargas dependientes del tiempo 8,9. Además, se utilizó un modelo de reología vítrea suave para ajustar los resultados y obtener un coeficiente de ley de potencia que caracteriza a los glóbulos rojos 8,9.
En general, la metodología desarrollada8,9, cuyo protocolo se describe en detalle a continuación, aclara las discrepancias anteriores utilizando los valores medidos para el factor de forma, Ff, que relaciona las fuerzas y deformaciones con tensiones y deformaciones en la superficie de los glóbulos rojos y puede utilizarse como un nuevo método de diagnóstico capaz de determinar cuantitativamente los parámetros viscoelásticos y las características vítreas blandas de los glóbulos rojos obtenidos de individuos con sangre diferente. Patologías. Dicha caracterización, utilizando el protocolo que se describe a continuación, puede abrir nuevas posibilidades para comprender el comportamiento de los glóbulos rojos desde una perspectiva mecanobiológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se presenta un método integrado basado en pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para mapear cuantitativamente las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos. Se determinan los resultados para los módulos de almacenamiento y pérdida de cizallamiento, junto con el exponente de escala que caracteriza la reología vítrea suave de los glóbulos rojos. Ya se ha llevado a cabo la aplicación de este protocolo para diferentes condiciones experimentales, como en la situación fisiológica<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a todos los miembros de la instalación de microscopía avanzada CENABIO por su importante ayuda. Este trabajo fue apoyado por las agencias brasileñas Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código Financiero 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) junto con Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. fue apoyado por una subvención JCNE de FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
