Kwantitatieve analyse van visco-elastische eigenschappen van rode bloedcellen met behulp van een optisch pincet en onscherpe microscopie
Summary
Hier wordt een geïntegreerd protocol op basis van een optisch pincet en defocusmicroscopie beschreven om de reologische eigenschappen van cellen te meten. Dit protocol is breed toepasbaar bij het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen van erytrocyten onder variabele fysio-pathologische omstandigheden.
Abstract
De visco-elastische eigenschappen van erytrocyten zijn onderzocht met behulp van een reeks technieken. De gerapporteerde experimentele gegevens variëren echter. Dit wordt niet alleen toegeschreven aan de normale variabiliteit van cellen, maar ook aan de verschillen in methoden en modellen van celrespons. Hier wordt een geïntegreerd protocol met behulp van optische pincetten en onscherpe microscopie gebruikt om de reologische kenmerken van rode bloedcellen in het frequentiebereik van 1 Hz tot 35 Hz te verkrijgen. Terwijl optische pincetten worden gebruikt om de erytrocyten-complexe elastische constante te meten, is defocusmicroscopie in staat om het celhoogteprofiel, volume en de vormfactor een parameter te verkrijgen die conversie van complexe elastische constante in complexe schuifmodulus mogelijk maakt. Bovendien kan door een zacht glasachtig reologiemodel toe te passen, de schaalexponent voor beide moduli worden verkregen. De ontwikkelde methodologie maakt het mogelijk om het mechanische gedrag van rode bloedcellen te onderzoeken, waarbij hun visco-elastische parameters worden gekarakteriseerd, verkregen onder goed gedefinieerde experimentele omstandigheden, voor verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden.
Introduction
Rijpe rode bloedcellen (RBC’s), ook bekend als erytrocyten, kunnen zich meer dan twee keer zo groot maken wanneer ze door de smalste haarvaten van het menselijk lichaam gaan1. Een dergelijke capaciteit wordt toegeschreven aan hun unieke vermogen om te vervormen wanneer ze worden blootgesteld aan externe belastingen.
In de afgelopen jaren hebben verschillende studies deze functie gekarakteriseerd in RBC-oppervlakken 2,3. Het gebied van de natuurkunde dat de elastische en viskeuze reacties van materialen als gevolg van externe belastingen beschrijft, wordt reologie genoemd. In het algemeen, wanneer een externe kracht wordt uitgeoefend, hangt de resulterende vervorming af van de eigenschappen van het materiaal en kan deze worden onderverdeeld in elastische vervormingen, die energie opslaan, of viskeuze vervormingen, die energie dissiperen4. Alle cellen, inclusief RBC’s, vertonen een visco-elastisch gedrag; Met andere woorden, energie wordt zowel opgeslagen als afgevoerd. De visco-elastische respons van een cel kan dus worden gekenmerkt door zijn complexe schuifmodulus G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω), waarbij G‘ (ω) de opslagmodulus is, gerelateerd aan het elastische gedrag, en G” (ω) de verliesmodulus is, gerelateerd aan zijn viscositeit4. Bovendien zijn fenomenologische modellen gebruikt om celresponsen te beschrijven, een van de meest gebruikte wordt het zachte glazige reologiemodel5 genoemd, gekenmerkt door een machtswetafhankelijkheid van de complexe schuifmodulus met de belastingsfrequentie.
Op één cel gebaseerde methoden zijn gebruikt om de visco-elastische eigenschappen van RBC’s te karakteriseren, door kracht toe te passen en verplaatsing te meten als functie van de opgelegde belasting 2,3. Voor de complexe schuifmodulus zijn echter weinig resultaten te vinden in de literatuur. Met behulp van dynamische lichtverstrooiing werden waarden voor RBC-opslag en verliesmoduli gerapporteerd, variërend van 0,01-1 Pa, in het frequentiebereik van 1-100 Hz6. Door gebruik te maken van optische magnetische twisting cytometrie werd een schijnbaar complexe elastische modulus verkregen7, en voor vergelijkingsdoeleinden werd beweerd dat een multiplicatieve factor mogelijk de discrepanties zou kunnen verduidelijken.
Meer recent werd een nieuwe methodologie op basis van optische pincetten (OT) samen met defocusmicroscopie (DM), als een geïntegreerd hulpmiddel om de opslag en het verlies van afschuifmoduli van menselijke erytrocyten over tijdsafhankelijke belastingen kwantitatief in kaart te brengen, vastgesteld 8,9. Daarnaast werd een zacht glasachtig reologiemodel gebruikt om de resultaten te passen en een vermogenswetcoëfficiënt te verkrijgen die de RBC’s 8,9 karakteriseert.
Over het algemeen verduidelijkt de ontwikkelde methodologie8,9, waarvan het protocol hieronder in detail wordt beschreven, eerdere discrepanties door gebruik te maken van de gemeten waarden voor de vormfactor, Ff, die krachten en vervormingen relateert aan spanningen en spanningen in het RBC-oppervlak en kan worden gebruikt als een nieuwe diagnostische methode die in staat is om kwantitatief de visco-elastische parameters en zachte glasachtige kenmerken van RBC’s verkregen van personen met verschillend bloed te bepalen Pathologieën. Een dergelijke karakterisering, met behulp van het hieronder beschreven protocol, kan nieuwe mogelijkheden openen om het gedrag van RBC’s vanuit een mechanobiologisch perspectief te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol wordt een geïntegreerde methode op basis van een optisch pincet en onscherpe microscopie gepresenteerd om de visco-elastische eigenschappen van RBC’s kwantitatief in kaart te brengen. Resultaten voor de opslag- en verliesschuifmoduli, samen met de schaalexponent die de zachte glasachtige reologie van RBC kenmerkt, worden bepaald. Toepassing van dit protocol voor verschillende experimentele omstandigheden, zoals in fysiologische situatie8 of langs elke fase van P. falciparum </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag alle leden van CENABIO geavanceerde microscopiefaciliteit bedanken voor alle belangrijke hulp. Dit werk werd ondersteund door de Braziliaanse agentschappen Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), en Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) samen met Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. werd ondersteund door een JCNE-subsidie van FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
