التحليل الكمي للخصائص اللزجة المرنة لخلايا الدم الحمراء باستخدام ملاقط بصرية والفحص المجهري اللابؤري
Summary
هنا ، يتم وصف بروتوكول متكامل يعتمد على الملقط البصري والفحص المجهري اللابؤري لقياس الخصائص الريولوجية للخلايا. هذا البروتوكول له قابلية تطبيق واسعة في دراسة الخصائص اللزجة المرنة لكريات الدم الحمراء في ظل ظروف فيزيائية مرضية متغيرة.
Abstract
تم التحقيق في الخصائص اللزجة المرنة لكريات الدم الحمراء من خلال مجموعة من التقنيات. ومع ذلك ، تختلف البيانات التجريبية المبلغ عنها. لا يعزى هذا فقط إلى التباين الطبيعي للخلايا ، ولكن أيضا إلى الاختلافات في طرق ونماذج استجابة الخلية. هنا ، يتم استخدام بروتوكول متكامل باستخدام ملاقط بصرية ومجهر إلغاء التركيز للحصول على السمات الريولوجية لخلايا الدم الحمراء في نطاق التردد من 1 هرتز إلى 35 هرتز. بينما يتم استخدام الملقط البصري لقياس الثابت المرن المعقد لكرات الدم الحمراء ، فإن الفحص المجهري اللابؤري قادر على الحصول على ملف تعريف ارتفاع الخلية وحجمها وعامل شكلها معلمة تسمح بتحويل ثابت المرونة المعقد إلى معامل قص معقد. علاوة على ذلك ، بتطبيق نموذج ريولوجي زجاجي ناعم ، يمكن الحصول على أس القياس لكلا المعيارين. تسمح المنهجية المطورة باستكشاف السلوك الميكانيكي لخلايا الدم الحمراء ، وتوصيف معلماتها اللزجة المرنة ، التي تم الحصول عليها في ظل ظروف تجريبية محددة جيدا ، للعديد من الحالات الفسيولوجية والمرضية.
Introduction
خلايا الدم الحمراء الناضجة (RBCs) ، والمعروفة أيضا باسم كريات الدم الحمراء ، قادرة على تمديد أكثر من ضعف حجمها عند المرور عبر أضيق الشعيرات الدموية في جسم الإنسان1. وتعزى هذه القدرة إلى قدرتها الفريدة على التشوه عند تعرضها لأحمال خارجية.
في السنوات الأخيرة ، ميزت دراسات مختلفة هذه الميزة في أسطح كرات الدم الحمراء 2,3. يسمى مجال الفيزياء الذي يصف الاستجابات المرنة واللزجة للمواد بسبب الأحمال الخارجية الريولوجيا. بشكل عام ، عندما يتم تطبيق قوة خارجية ، يعتمد التشوه الناتج على خصائص المادة ويمكن تقسيمه إلى تشوهات مرنة ، تخزن الطاقة ، أو التشوهات اللزجة ، التي تبدد الطاقة4. جميع الخلايا ، بما في ذلك كرات الدم الحمراء ، تظهر سلوكا لزجا مرنا. بمعنى آخر ، يتم تخزين الطاقة وتبديدها. وبالتالي يمكن وصف الاستجابة اللزجة المرنة للخلية بمعامل القص المعقد G * (ω) = G ‘(ω) + iG “(ω) ، حيث G ‘ (ω) هو معامل التخزين ، المرتبط بالسلوك المرن ، و G” (ω) هو معامل الفقد ، المتعلق بلزوجته4. علاوة على ذلك ، تم استخدام النماذج الظاهرية لوصف استجابات الخلايا ، ويطلق على أحد أكثرها استخداما نموذج الريولوجيا الزجاجيةالناعمة 5 ، والذي يتميز باعتماد قانون الطاقة لمعامل القص المعقد مع تردد الحمل.
تم استخدام الطرق القائمة على الخلية الواحدة لتوصيف الخصائص اللزجة المرنة لكرات الدم الحمراء ، من خلال تطبيق القوة وقياس الإزاحة كدالة للحمل المفروض 2,3. ومع ذلك ، بالنسبة لمعامل القص المعقد ، يمكن العثور على نتائج قليلة في الأدبيات. باستخدام تشتت الضوء الديناميكي ، تم الإبلاغ عن قيم تخزين كرات الدم الحمراء ووحدات الخسارة تتراوح من 0.01-1 باسكال ، في نطاق تردد 1-100 هرتز6. باستخدام القياس الخلوي الملتوي المغناطيسي البصري ، تم الحصول على معامل مرونة معقد ظاهر7 ، ولأغراض المقارنة ، زعم أن العامل المضاعف ربما يوضح التناقضات.
في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء منهجية جديدة تعتمد على الملقط البصري (OT) جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري اللابؤري (DM) ، كأداة متكاملة لرسم خريطة كمية لتخزين وفقدان وحدات القص لكريات الدم الحمراء البشرية على الأحمال المعتمدة على الوقت ، 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نموذج ريولوجي زجاجي ناعم لتناسب النتائج والحصول على معامل قانون الطاقة الذي يميز كرات الدمالحمراء 8,9.
بشكل عام ، توضح المنهجية المطورة 8,9 ، التي تم وصف البروتوكول بالتفصيل أدناه ، التناقضات السابقة باستخدام القيم المقاسة لعامل الشكل ، Ff ، الذي يربط القوى والتشوهات بالضغوط والإجهاد في سطح كرات الدم الحمراء ويمكن استخدامه كطريقة تشخيصية جديدة قادرة على تحديد المعلمات اللزجة المرنة والسمات الزجاجية الناعمة لكرات الدم الحمراء التي تم الحصول عليها من الأفراد ذوي الدم المختلف الامراض. مثل هذا التوصيف ، باستخدام البروتوكول الموضح أدناه ، قد يفتح إمكانيات جديدة لفهم سلوك كرات الدم الحمراء من منظور ميكانيكي بيولوجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طريقة متكاملة تعتمد على الملقط البصري والفحص المجهري اللابؤري لرسم خريطة كمية للخصائص اللزجة المرنة لكرات الدم الحمراء. يتم تحديد نتائج وحدات قص التخزين والخسارة ، جنبا إلى جنب مع أس التحجيم الذي يميز الريولوجيا الزجاجية الناعمة لكرات الدم الحمراء. تم بالفع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مرفق الفحص المجهري المتقدم CENABIO للمساعدة المهمة للغاية. وحظي هذا العمل بدعم الوكالات البرازيلية “المجلس الوطني للتنمية المدنية والتكنولوجية (CNPq)، والمجلس الوطني لإنفاذ الحقوق الدستورية (CAPES) – القانون المالي رقم 001، ومؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية في مجال التنمية في ولاية ريو دي جانيرو، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا في فلويدوس كومبلكس، جنبا إلى جنب مع مؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية (PESPI) جنبا إلى جنب مع مؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية (Pesquisa do Estado de São Paulo). تم دعم BP بمنحة JCNE من FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
