Analisi quantitativa delle proprietà viscoelastiche dei globuli rossi mediante pinzetta ottica e microscopia di defocalizzazione
Summary
Qui viene descritto un protocollo integrato basato su pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione per misurare le proprietà reologiche delle cellule. Questo protocollo ha ampia applicabilità nello studio delle proprietà viscoelastiche degli eritrociti in condizioni fisio-patologiche variabili.
Abstract
Le proprietà viscoelastiche degli eritrociti sono state studiate con una serie di tecniche. Tuttavia, i dati sperimentali riportati variano. Ciò non è solo attribuito alla normale variabilità delle cellule, ma anche alle differenze nei metodi e nei modelli di risposta cellulare. Qui, un protocollo integrato che utilizza pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione viene impiegato per ottenere le caratteristiche reologiche dei globuli rossi nella gamma di frequenza da 1 Hz a 35 Hz. Mentre le pinzette ottiche sono utilizzate per misurare la costante elastica del complesso eritrocitario, la microscopia di defocalizzazione è in grado di ottenere il profilo di altezza della cella, il volume e il suo fattore di forma un parametro che consente la conversione della costante elastica complessa in modulo di taglio complesso. Inoltre, applicando un modello di reologia vetrosa morbida, è possibile ottenere l’esponente di scala per entrambi i moduli. La metodologia sviluppata permette di esplorare il comportamento meccanico dei globuli rossi, caratterizzandone i parametri viscoelastici, ottenuti in condizioni sperimentali ben definite, per diverse condizioni fisiologiche e patologiche.
Introduction
I globuli rossi maturi (RBC), noti anche come eritrociti, sono in grado di estendersi più del doppio delle loro dimensioni quando passano attraverso i capillari più stretti del corpo umano1. Tale capacità è attribuita alla loro capacità unica di deformarsi quando sottoposta a carichi esterni.
Negli ultimi anni, diversi studi hanno caratterizzato questa caratteristica nelle superfici RBC 2,3. L’area della fisica che descrive le risposte elastiche e viscose dei materiali dovute a carichi esterni è chiamata reologia. In generale, quando viene applicata una forza esterna, la deformazione risultante dipende dalle proprietà del materiale e può essere suddivisa in deformazioni elastiche, che immagazzinano energia, o deformazioni viscose, che dissipano energia4. Tutte le cellule, compresi i globuli rossi, mostrano un comportamento viscoelastico; In altre parole, l’energia viene immagazzinata e dissipata. La risposta viscoelastica di una cellula può quindi essere caratterizzata dal suo modulo di taglio complesso G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω), dove G‘ (ω) è il modulo di accumulo, correlato al comportamento elastico, e G” (ω) è il modulo di perdita, correlato alla sua viscosità4. Inoltre, sono stati utilizzati modelli fenomenologici per descrivere le risposte cellulari, uno dei più utilizzati è chiamato il modello 5 di reologia vetrosa morbida, caratterizzato da una dipendenza dalla legge di potenza del modulo di taglio complesso con la frequenza di carico.
Sono stati impiegati metodi basati su singole cellule per caratterizzare le proprietà viscoelastiche dei globuli rossi, applicando forza e misurando lo spostamento in funzione del carico imposto 2,3. Tuttavia, per il complesso modulo di taglio, pochi risultati possono essere trovati in letteratura. Utilizzando la diffusione dinamica della luce, sono stati riportati valori per i moduli di stoccaggio e perdita di RBC variabili da 0,01-1 Pa, nella gamma di frequenza 1-100 Hz6. Utilizzando la citometria a torsione magnetica ottica, è stato ottenuto un modulo elastico complesso apparente7 e, a scopo di confronto, è stato affermato un fattore moltiplicativo per chiarire eventualmente le discrepanze.
Più recentemente, è stata stabilita una nuova metodologia basata su pinzette ottiche (OT) insieme alla microscopia di defocalizzazione (DM), come strumento integrato per mappare quantitativamente l’immagazzinamento e la perdita dei moduli di taglio degli eritrociti umani su carichi dipendenti dal tempo 8,9. Inoltre, è stato utilizzato un modello reologico vetroso morbido per adattarsi ai risultati e ottenere un coefficiente di legge di potenza che caratterizza i globuli rossi 8,9.
Nel complesso, la metodologia sviluppata8,9, il cui protocollo è descritto in dettaglio di seguito, chiarisce le precedenti discrepanze utilizzando i valori misurati per il fattore di forma, Ff, che mette in relazione forze e deformazioni con sollecitazioni e deformazioni nella superficie dei globuli rossi e può essere utilizzato come nuovo metodo diagnostico in grado di determinare quantitativamente i parametri viscoelastici e le caratteristiche vetrose morbide dei globuli rossi ottenuti da individui con sangue diverso Patologie. Tale caratterizzazione, utilizzando il protocollo descritto di seguito, può aprire nuove possibilità per comprendere il comportamento dei globuli rossi da una prospettiva meccanobiologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, viene presentato un metodo integrato basato su pinzette ottiche e microscopia di defocalizzazione per mappare quantitativamente le proprietà viscoelastiche dei globuli rossi. Vengono determinati i risultati per i moduli di taglio di stoccaggio e perdita, insieme all’esponente di scala che caratterizza la reologia vetrosa morbida dei globuli rossi. L’applicazione di questo protocollo per diverse condizioni sperimentali, come nella situazione fisiologica8 o lungo ogni stadio<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri della struttura di microscopia avanzata CENABIO per l’importante aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle agenzie brasiliane Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) insieme a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. è stato sostenuto da una sovvenzione JCNE di FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
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