Kvantitativ analyse av viskoelastiske egenskaper til røde blodlegemer ved hjelp av optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi
Summary
Her beskrives en integrert protokoll basert på optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi for å måle cellens reologiske egenskaper. Denne protokollen har bred anvendelighet ved å studere de viskoelastiske egenskapene til erytrocytter under variable fysiopatologiske forhold.
Abstract
De viskoelastiske egenskapene til erytrocytter har blitt undersøkt ved hjelp av en rekke teknikker. De rapporterte eksperimentelle dataene varierer imidlertid. Dette tilskrives ikke bare den normale variasjonen av celler, men også til forskjellene i metoder og modeller for cellerespons. Her brukes en integrert protokoll ved hjelp av optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi for å oppnå de reologiske egenskapene til røde blodlegemer i frekvensområdet 1 Hz til 35 Hz. Mens optisk pinsett brukes til å måle erytrocytkompleksets elastiske konstant, er defokuseringsmikroskopi i stand til å oppnå cellehøydeprofilen, volumet og dens formfaktor en parameter som tillater konvertering av kompleks elastisk konstant til kompleks skjærmodul. Ved å anvende en myk glassaktig reologimodell, kan skaleringseksponenten for begge modulene oppnås. Den utviklede metoden gjør det mulig å utforske den mekaniske oppførselen til røde blodlegemer, karakterisere deres viskoelastiske parametere, oppnådd under veldefinerte eksperimentelle forhold, for flere fysiologiske og patologiske forhold.
Introduction
Eldre røde blodlegemer (RBC), også kjent som erytrocytter, er i stand til å strekke seg mer enn dobbelt så store når de passerer gjennom de smaleste kapillærenei menneskekroppen. Slike kapasiteter tilskrives deres unike evne til å deformere når de utsettes for ytre belastninger.
De siste årene har forskjellige studier karakterisert denne funksjonen i RBC-overflater 2,3. Fysikkområdet som beskriver materialets elastiske og viskøse responser på grunn av ytre belastninger kalles reologi. Generelt, når en ekstern kraft påføres, avhenger den resulterende deformasjonen av materialets egenskaper og kan deles inn i elastiske deformasjoner, som lagrer energi, eller viskøse deformasjoner, som sprer energi4. Alle celler, inkludert RBC, utviser en viskoelastisk oppførsel; Med andre ord blir energi både lagret og spredt. Den viskoelastiske responsen til en celle kan således karakteriseres ved dens komplekse skjærmodul G * (ω) = G'(ω) + iG”(ω), hvor G ‘(ω) er lagringsmodulen, relatert til den elastiske oppførselen, og G “(ω) er tapsmodulen, relatert til viskositeten4. Videre har fenomenologiske modeller blitt brukt til å beskrive celleresponser, en av de mest brukte kalles den myke glassaktige reologimodellen5, preget av en kraftlovavhengighet av den komplekse skjærmodulen med lastfrekvensen.
Encellebaserte metoder har blitt brukt til å karakterisere de viskoelastiske egenskapene til RBC, ved å anvende kraft og måle forskyvning som en funksjon av den påførte belastningen 2,3. For den komplekse skjærmodulen finnes imidlertid få resultater i litteraturen. Ved bruk av dynamisk lysspredning ble verdier for RBC-lagring og tapsmoduli rapportert varierende fra 0,01-1 Pa, i frekvensområdet 1-100 Hz6. Ved bruk av optisk magnetisk vridningscytometri fikk man en tilsynelatende kompleks elastisk modul7, og for sammenlikningsformål hevdet man en multiplikativ faktor som eventuelt kunne avklare avvikene.
Mer nylig bledet etablert en ny metodikk basert på optisk pinsett (OT) sammen med defokuseringsmikroskopi (DM), som et integrert verktøy for kvantitativt å kartlegge lagring og tap av skjærmoduler av humane erytrocytter over tidsavhengige belastninger, 8,9. I tillegg ble en myk glassaktig reologimodell brukt for å passe resultatene og oppnå en kraftlovkoeffisient som karakteriserer RBCene 8,9.
Samlet sett klargjør den utviklede metodikken8,9, protokollen som er beskrevet i detalj nedenfor, tidligere uoverensstemmelser ved å bruke de målte verdiene for formfaktoren, Ff, som relaterer krefter og deformasjoner til spenninger og tøyninger i RBC-overflaten og kan brukes som en ny diagnostisk metode som er i stand til kvantitativt å bestemme viskoelastiske parametere og myke glassaktige egenskaper av RBC oppnådd fra individer med forskjellig blod Patologi. Slik karakterisering, ved hjelp av protokollen beskrevet nedenfor, kan åpne for nye muligheter for å forstå oppførselen til RBC fra et mekanobiologisk perspektiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen presenteres en integrert metode basert på optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi for kvantitativt å kartlegge de viskoelastiske egenskapene til RBC. Resultater for lagrings- og tapsskjærmoduli, sammen med skaleringseksponenten som karakteriserer den myke glassaktige reologien til RBC, bestemmes. Anvendelse av denne protokollen for forskjellige eksperimentelle forhold, som i fysiologisk situasjon8 eller langs hvert stadium av P. falciparum intra-erytrocytisk syklu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmene av CENABIOs avanserte mikroskopianlegg for viktig hjelp. Dette arbeidet ble støttet av de brasilianske byråene Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), og Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) sammen med Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). BP ble støttet av et JCNE-stipend fra FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
