Количественный анализ вязкоупругих свойств эритроцитов с помощью оптического пинцета и расфокусирующей микроскопии
Summary
Здесь описан интегрированный протокол, основанный на оптическом пинцете и расфокусирующей микроскопии для измерения реологических свойств клеток. Данный протокол имеет широкое применение при изучении вязкоупругих свойств эритроцитов при вариабельных физиопатологических условиях.
Abstract
Вязкоупругие свойства эритроцитов исследованы с помощью ряда методов. Однако сообщаемые экспериментальные данные варьируются. Это связано не только с нормальной изменчивостью клеток, но и с различиями в методах и моделях клеточного ответа. Здесь используется интегрированный протокол с использованием оптического пинцета и расфокусирующей микроскопии для получения реологических характеристик эритроцитов в диапазоне частот от 1 Гц до 35 Гц. В то время как оптический пинцет используется для измерения эритроцитарно-комплексной эластичной постоянной, расфокусирующая микроскопия способна получить профиль высоты, объем и форм-фактор клетки, параметр, который позволяет преобразовать сложную упругую константу в сложный модуль сдвига. Кроме того, применяя модель мягкой стекловидной реологии, можно получить показатель масштабирования для обоих модулей. Разработанная методика позволяет исследовать механическое поведение эритроцитов, характеризуя их вязкоупругие параметры, полученные в четко определенных экспериментальных условиях, при ряде физиологических и патологических состояний.
Introduction
Зрелые эритроциты (эритроциты), также известные как эритроциты, способны расширяться более чем в два раза по размеру при прохождении через самые узкие капилляры человеческого тела1. Такая способность объясняется их уникальной способностью деформироваться при воздействии внешних нагрузок.
В последние годы различные исследования охарактеризовали эту особенность на поверхностях эритроцитов 2,3. Область физики, описывающая упругие и вязкие реакции материалов из-за внешних нагрузок, называется реологией. Как правило, при приложении внешней силы результирующая деформация зависит от свойств материала и может быть разделена на упругие деформации, которые накапливают энергию, или вязкие деформации, которые рассеивают энергию4. Все клетки, включая эритроциты, проявляют вязкоупругое поведение; Другими словами, энергия как накапливается, так и рассеивается. Таким образом, вязкоупругий отклик ячейки можно охарактеризовать ее комплексным модулем сдвига G*(ω) = G'(ω) + iG“(ω), где G‘ (ω) – модуль накопления, связанный с упругим поведением, а G” (ω) – модуль потерь, связанный с его вязкостью4. Кроме того, для описания клеточных реакций использовались феноменологические модели, одна из наиболее часто используемых называется мягкой стеклянной реологической моделью5, характеризующейся степенной зависимостью модуля комплексного сдвига от частоты нагрузки.
Для характеристики вязкоупругих свойств эритроцитов были использованы одноячеистые методы путем приложения силы и измерения смещения в зависимости от приложенной нагрузки 2,3. Однако для комплексного модуля сдвига в литературе можно найти мало результатов. При использовании динамического рассеяния света значения модулей хранения и потерь эритроцитов варьировались от 0,01 до 1 Па в диапазоне частот от 1 до 100Гц 6. С помощью опто-магнитной скручивающей цитометрии был получен кажущийся сложный модуль упругости7, и для целей сравнения был заявлен мультипликативный коэффициент, который, возможно, прояснит расхождения.
Совсем недавно была создана новая методология, основанная на оптическом пинцете (ОТ) вместе с расфокусирующей микроскопией (ДМ), как интегрированный инструмент для количественного картирования хранения и потери модулей сдвига эритроцитов человека при нагрузках, зависящих от времени 8,9. Кроме того, была использована модель мягкой стекловидной реологии для подгонки результатов и получения степенного коэффициента, характеризующего эритроциты 8,9.
В целом, разработанная методика8,9, протокол для которой подробно описан ниже, проясняет предыдущие расхождения с использованием измеренных значений для форм-фактора Ff, который связывает силы и деформации с напряжениями и деформациями на поверхности эритроцитов и может быть использован в качестве нового метода диагностики, способного количественно определять вязкоупругие параметры и мягкие стекловидные свойства эритроцитов, полученных от лиц с разной кровью Патологий. Такая характеристика с использованием протокола, описанного ниже, может открыть новые возможности для понимания поведения эритроцитов с механобиологической точки зрения.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе представлен интегрированный метод на основе оптического пинцета и расфокусирующей микроскопии для количественного картирования вязкоупругих свойств эритроцитов. Определены результаты по модулям хранения и сдвига потерь, а также показатель масштабирования, характе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность всем сотрудникам передового микроскопического центра CENABIO за очень важную помощь. Эта работа была поддержана бразильскими агентствами Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) и Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) совместно с Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Б.. был поддержан грантом JCNE от FAPERJ.
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
References
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
- Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
- Boal, D. . Mechanics of the Cell. 2 edn. , (2012).
- Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
- Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
- Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
- Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
- Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
- Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
- Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
- Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
- Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
- Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
- Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).
