Toepassing van RNA-interferentie in de dennenaaltjes, Bursaphelenchus xylophilus
Summary
Hier introduceren we een gedetailleerde soaking-methode van RNA-interferentie in Bursaphelenchus xylophilus om de studie van genfuncties te vergemakkelijken.
Abstract
De dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus, is een van de meest destructieve invasieve soorten ter wereld en veroorzaakt het verwelken en uiteindelijk sterven van pijnbomen. Ondanks de erkenning van hun economische en ecologische betekenis, is het tot nu toe onmogelijk geweest om de gedetailleerde genfuncties van plantparasitaire nematoden (PPN’s) te bestuderen met behulp van conventionele voorwaartse genetica en transgene methoden. Als omgekeerde geneticatechnologie vergemakkelijkt RNA-interferentie (RNAi) echter de studie van de functionele genen van nematoden, waaronder B. xylophilus.
Dit artikel schetst een nieuw protocol voor RNAi van het ppm-1-gen in B. xylophilus, waarvan is gemeld dat het een cruciale rol speelt bij de ontwikkeling en reproductie van andere pathogene nematoden. Voor RNAi was de T7-promotor gekoppeld aan de 5′-terminal van het doelfragment door polymerasekettingreactie (PCR) en dubbelstrengs RNA (dsRNA) werd gesynthetiseerd door in vitro transcriptie. Vervolgens werd dsRNA-afgifte bereikt door de nematoden te weken in een dsRNA-oplossing gemengd met synthetische neurostimulantia. Gesynchroniseerde juvenielen van B. xylophilus (ongeveer 20.000 personen) werden gewassen en gedrenkt in dsRNA (0,8 μg / ml) in de weekbuffer gedurende 24 uur in het donker bij 25 °C.
Dezelfde hoeveelheid nematoden werd in een weekbuffer geplaatst zonder dsRNA als controle. Ondertussen werd een andere identieke hoeveelheid nematoden in een weekbuffer geplaatst met groen fluorescerend eiwit (gfp) gen dsRNA als controle. Na het weken werd het expressieniveau van de doeltranscripten bepaald met behulp van real-time kwantitatieve PCR. De effecten van RNAi werden vervolgens bevestigd met behulp van microscopische observatie van de fenotypen en een vergelijking van de lichaamsgrootte van de volwassenen tussen de groepen. Het huidige protocol kan helpen bij het bevorderen van onderzoek om de functies van de genen van B. xylophilus en andere parasitaire nematoden beter te begrijpen in de richting van het ontwikkelen van controlestrategieën door middel van genetische manipulatie.
Introduction
Plantparasitaire nematoden (PPN’s) vormen een voortdurende bedreiging voor de voedselzekerheid en bosecosystemen. Ze veroorzaken naar schatting 100 miljard USD aan economische verliezen per jaar1, waarvan de meest problematische voornamelijk wortelknoopnematoden, cystenematoden en dennenhoutnematoden zijn. De dennenaaltje Bursaphelenchus xylophilus is een migrerende, endoparasitaire nematode, de oorzakelijke ziekteverwekker van dennenverwelkingsziekte2. Het heeft wereldwijd grote schade toegebracht aan dennenbossen3. In de terminologie van Van Megen et al.4 is B. xylophilus een lid van de Parasitaphelenchidae en behoort tot clade 10, terwijl de meeste andere belangrijke plantenparasieten tot clade 12 behoren.
Als onafhankelijke en recent geëvolueerde plantenparasiet is B. xylophilus een aantrekkelijk model voor vergelijkende studies. Tot op heden is er substantieel onderzoek gedaan naar wortelknoopnematoden en cystenematoden die behoren tot clade 12, die obligate, sedentaire endoparasieten zijn en enkele van de meest intensief bestudeerde nematoden zijn. Het uitvoeren van verder onderzoek op dit belangrijke gebied brengt echter een grote uitdaging met zich mee: de functie van parasitismegenen is een onderzoeksknelpunt. Functionele studies omvatten over het algemeen ectopische expressie en knockdown / out-experimenten, maar vertrouwen op effectieve genetische transformatieprotocollen voor de nematode. Als gevolg hiervan is omgekeerde genetica in PPN’s bijna uitsluitend afhankelijk van gen-uitschakeling door RNAi.
RNAi, een mechanisme dat op grote schaal aanwezig is in eukaryote cellen, legt genexpressie stil door dubbelstrengs RNA (dsRNA) te introduceren5. Tot op heden is het posttranscriptionele gen-uitschakelingsmechanisme geïnduceerd door dsRNA gevonden in alle bestudeerde eukaryoten, en RNAi-technologie, als een hulpmiddel voor functioneel genomica-onderzoek en andere toepassingen, heeft zich snel ontwikkeld in veel organismen. Sinds de ontdekking van de RNAi-machinerie in Caenorhabditis elegans in 19986 zijn RNAi-technieken effectieve methoden geworden voor het identificeren van de genfunctie van nematoden en worden ze voorgesteld als een nieuwe manier om pathogene nematoden effectief te bestrijden7.
RNAi is technisch gezien gemakkelijk te weken de juvenielen in dsRNA kan volstaan; de werkzaamheid en reproduceerbaarheid van deze aanpak lopen echter sterk uiteen met de aaltjessoorten en het doelgen8. Het uitschakelen van 20 genen die betrokken zijn bij de RNAi-routes van de wortelknoopnematode, Meloidogyne incognita, werd onderzocht met behulp van lange dsRNA’s als triggers, wat resulteerde in verschillende reacties, waaronder een toename en geen verandering in de expressie van sommige genen9. Deze resultaten tonen aan dat doelgenen anders kunnen reageren op RNAi knockdown, waardoor een uitputtende beoordeling van hun geschiktheid als doelwit voor nematodencontrole via RNAi noodzakelijk is. Er is momenteel echter een gebrek aan onderzoek naar de ontwikkelings- en voortplantingsbiologie van B. xylophilus.
Als voortzetting van eerder werk 10,11,12,13 beschrijven we hier een protocol voor het toepassen van RNAi om de functie van het ppm-1 gen van B. xylophilus te bestuderen, inclusief de synthese van dsRNA, synthetische neurostimulant soaking en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) detectie. De kennis die is opgedaan met deze experimentele aanpak zal waarschijnlijk aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van fundamentele biologische systemen en het voorkomen van dennenverwelkingsziekte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de levensgeschiedenis en parasitaire omgeving van B. xylophilus verschillen van die van andere nematoden, is er beperkt onderzoek gedaan naar de moleculaire pathogenese van deze plantpathogeen. Ondanks grote vooruitgang bij de toepassing van CRISPR/Cas9-genoombewerkingstechnologie in C. elegans en andere nematoden, is tot op heden alleen RNAi-technologie gepubliceerd die is toegepast op B. xylophilus 17. RNAi is een van de krachtigste hulpmiddelen die beschikbaar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) en gezamenlijk gefinancierd door het Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. , 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
