Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus
Summary
Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.
Abstract
Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist eine der zerstörerischsten invasiven Arten weltweit, die das Welken und schließlich das Absterben von Kiefern verursacht. Trotz der Anerkennung ihrer ökonomischen und ökologischen Bedeutung war es bisher unmöglich, die detaillierten Genfunktionen von pflanzenparasitischen Nematoden (PPNs) mit konventioneller Vorwärtsgenetik und transgenen Methoden zu untersuchen. Als umgekehrte genetische Technologie erleichtert die RNA-Interferenz (RNAi) jedoch die Untersuchung der funktionellen Gene von Nematoden, einschließlich B. xylophilus.
Dieser Artikel skizziert ein neues Protokoll für RNAi des ppm-1-Gens in B. xylophilus, von dem berichtet wurde, dass es eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reproduktion anderer pathogener Nematoden spielt. Für RNAi wurde der T7-Promotor durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem 5′-Terminal des Zielfragments verknüpft, und doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Anschließend wurde die dsRNA-Abgabe erreicht, indem die Nematoden in einer dsRNA-Lösung mit synthetischen Neurostimulanzien eingeweicht wurden. Synchronisierte Jungtiere von B. xylophilus (ca. 20.000 Individuen) wurden gewaschen und im Einweichpuffer für 24 h im Dunkeln bei 25 °C in dsRNA (0,8 μg/ml) eingeweicht.
Die gleiche Menge an Nematoden wurde in einen Einweichpuffer ohne dsRNA als Kontrolle gegeben. In der Zwischenzeit wurde eine weitere identische Menge von Nematoden in einen Einweichpuffer mit dem grün fluoreszierenden Protein (gfp) -Gen dsRNA als Kontrolle gegeben. Nach dem Einweichen wurde das Expressionsniveau der Zieltranskripte mittels quantitativer real-time PCR bestimmt. Die Wirkung von RNAi wurde dann durch mikroskopische Beobachtung der Phänotypen und einen Vergleich der Körpergröße der Erwachsenen unter den Gruppen bestätigt. Das aktuelle Protokoll kann dazu beitragen, die Forschung voranzutreiben, um die Funktionen der Gene von B. xylophilus und anderen parasitären Nematoden besser zu verstehen, um Kontrollstrategien durch Gentechnik zu entwickeln.
Introduction
Pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) sind eine anhaltende Bedrohung für die Ernährungssicherheit und die Waldökosysteme. Sie verursachen jedes Jahr schätzungsweise 100 Milliarden USD an wirtschaftlichen Verlusten1, von denen die problematischsten vor allem Wurzelknotennematoden, Zystennematoden und Kiefernnematoden sind. Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist ein wandernder, endoparasitischer Fadenwurm, der der ursächliche Erreger der Kiefernwelkeist 2. Es hat den Kiefernwäldern weltweit großen Schaden zugefügt3. Nach der Terminologie von Van Megen et al.4 ist B. xylophilus ein Mitglied der Parasitaphelenchidae und gehört zur Klade 10, während die meisten anderen wichtigen Pflanzenparasiten zur Klade 12 gehören.
Als eigenständiger und neu entwickelter Pflanzenparasit ist B. xylophilus ein attraktives Modell für vergleichende Studien. Bis heute gibt es umfangreiche Forschungen über Wurzelknotennematoden und Zystennematoden der Klade 12, die obligate, sitzende Endoparasiten sind und zu den am intensivsten untersuchten Nematoden gehören. Die weitere Forschung auf diesem wichtigen Gebiet ist jedoch mit einer großen Herausforderung verbunden: Die Funktion von Parasitengenen ist ein Forschungsengpass. Funktionelle Studien umfassen im Allgemeinen ektopische Expressions- und Knockdown- / Out-Experimente, stützen sich jedoch auf effektive genetische Transformationsprotokolle für den Nematoden. Infolgedessen beruht die umgekehrte Genetik in PPNs fast ausschließlich auf Gen-Silencing durch RNAi.
RNAi, ein Mechanismus, der in eukaryotischen Zellen weit verbreitet ist, bringt die Genexpression zum Schweigen, indem er doppelsträngige RNA (dsRNA) einführt5. Bis heute wurde der durch dsRNA induzierte posttranskriptionelle Gen-Silencing-Mechanismus in allen untersuchten Eukaryoten gefunden, und die RNAi-Technologie als Werkzeug der funktionellen Genomforschung und anderer Anwendungen hat sich in vielen Organismen schnell entwickelt. Seit der Entdeckung der RNAi-Maschinerie in Caenorhabditis elegans im Jahr 19986 haben sich RNAi-Techniken zu wirksamen Methoden zur Identifizierung der Genfunktion von Nematoden entwickelt und werden als neuer Weg zur wirksamen Kontrolle pathogener Nematoden vorgeschlagen7.
RNAi ist technisch das Einweichen der Jungtiere in dsRNA kann ausreichen; Die Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes variiert jedoch stark mit der Nematodenspezies und dem Zielgen8. Die Stummschaltung von 20 Genen, die an den RNAi-Signalwegen des Wurzelknotennematoden, Meloidogyne incognita, beteiligt sind, wurde unter Verwendung langer dsRNAs als Auslöser untersucht, was zu verschiedenen Reaktionen führte, einschließlich einer Zunahme und keiner Veränderung der Expression einiger Gene9. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zielgene unterschiedlich auf RNAi-Knockdown reagieren können, was eine umfassende Bewertung ihrer Eignung als Ziele für die Nematodenkontrolle über RNAi erfordert. Derzeit gibt es jedoch einen Mangel an Forschung zur Entwicklungs- und Fortpflanzungsbiologie von B. xylophilus.
Als Fortsetzung der früheren Arbeit10,11,12,13 beschreiben wir hier ein Protokoll zur Anwendung von RNAi zur Untersuchung der Funktion des ppm-1-Gens von B. xylophilus, einschließlich der Synthese von dsRNA, des Einweichens synthetischer Neurostimulanzien und des quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsnachweises (qPCR). Die Erkenntnisse aus diesem experimentellen Ansatz werden wahrscheinlich deutlich zum Verständnis grundlegender biologischer Systeme und zur Vorbeugung von Kiefernwelke beitragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl sich die Lebensgeschichte und die parasitäre Umgebung von B. xylophilus von denen anderer Nematoden unterscheiden, gibt es nur begrenzte Forschung über die molekulare Pathogenese dieses Pflanzenpathogens. Trotz großer Fortschritte bei der Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie bei C. elegans und anderen Nematoden wurde bisher nur die RNAi-Technologie veröffentlicht, die auf B. xylophilus angewendet wurde17. RNAi ist eines der leistungsfähigsten v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) finanziert und gemeinsam durch den Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004) finanziert.
Materials
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
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