Tillämpning av RNA-interferens i pinewoodnematoden, Bursaphelenchus xylophilus
Summary
Här introducerar vi en detaljerad blötläggningsmetod för RNA-interferens i Bursaphelenchus xylophilus för att underlätta studien av genfunktioner.
Abstract
Tallvedsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, är en av de mest destruktiva invasiva arterna i världen och orsakar vissnande och eventuell död av tallar. Trots erkännandet av deras ekonomiska och miljömässiga betydelse har det hittills varit omöjligt att studera de detaljerade genfunktionerna hos växtparasitiska nematoder (PPN) med hjälp av konventionell framåtgenetik och transgena metoder. Men som en omvänd genetikteknik underlättar RNA-interferens (RNAi) studien av de funktionella generna av nematoder, inklusive B. xylophilus.
Detta dokument beskriver ett nytt protokoll för RNAi av ppm-1-genen i B. xylophilus, som har rapporterats spela avgörande roller i utvecklingen och reproduktionen av andra patogena nematoder. För RNAi var T7-promotorn kopplad till 5′-terminalen i målfragmentet genom polymeraskedjereaktion (PCR), och dubbelsträngat RNA (dsRNA) syntetiserades genom in vitro-transkription. Därefter åstadkoms dsRNA-leverans genom blötläggning av nematoderna i en dsRNA-lösning blandad med syntetiska neurostimulanter. Synkroniserade ungar av B. xylophilus (cirka 20 000 individer) tvättades och blötläggdes i dsRNA (0,8 μg/ml) i blötläggningsbufferten i 24 timmar i mörker vid 25 °C.
Samma mängd nematoder placerades i en blötläggningsbuffert utan dsRNA som kontroll. Under tiden placerades en annan identisk mängd nematoder i en blötläggningsbuffert med grön fluorescerande protein (gfp) gen dsRNA som kontroll. Efter blötläggning bestämdes uttrycksnivån för måltranskriptionerna med hjälp av kvantitativ PCR i realtid. Effekterna av RNAi bekräftades sedan med hjälp av mikroskopisk observation av fenotyperna och en jämförelse av kroppsstorleken hos de vuxna bland grupperna. Det nuvarande protokollet kan hjälpa till att främja forskning för att bättre förstå funktionerna hos generna av B. xylophilus och andra parasitiska nematoder mot att utveckla kontrollstrategier genom genteknik.
Introduction
Växtparasitära nematoder (PPN) är ett fortsatt hot mot livsmedelstryggheten och skogsekosystemen. De orsakar uppskattningsvis 100 miljarder USD i ekonomiska förluster varje år1, varav de mest problematiska främst är rotknutnematoder, cystnematoder och tallvedsnematoder. Pinewoodnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, är en migrerande, endoparasitisk nematod, som är den kausala patogenen av tallvisssjukdom2. Det har orsakat stor skada på tallskogar över hela världen3. Med hjälp av terminologin i Van Megen et al.4 är B. xylophilus medlem av Parasitaphelenchidae och tillhör klad 10, medan de flesta andra stora växtparasiter tillhör klad 12.
Som en oberoende och nyligen utvecklad växtparasit är B. xylophilus en attraktiv modell för jämförande studier. Hittills har det gjorts omfattande forskning om rotknutnematoder och cystnematoder som tillhör klad 12, som är obligatoriska, stillasittande endoparasiter och är några av de mest intensivt studerade nematoderna. Att bedriva ytterligare forskning inom detta viktiga område kommer dock med en stor utmaning: parasitismgenernas funktion är en flaskhals i forskningen. Funktionella studier inkluderar i allmänhet ektopiskt uttryck och knockdown / out-experiment men förlitar sig på effektiva genetiska transformationsprotokoll för nematoden. Som ett resultat är omvänd genetik i PPN nästan uteslutande beroende av gendämpning av RNAi.
RNAi, en mekanism som är allmänt närvarande i eukaryota celler, tystar genuttryck genom att införa dubbelsträngat RNA (dsRNA)5. Hittills har den posttranskriptionella gendämpningsmekanismen inducerad av dsRNA hittats i alla studerade eukaryoter, och RNAi-teknik, som ett verktyg för funktionell genomikforskning och andra applikationer, har utvecklats snabbt i många organismer. Sedan upptäckten av RNAi-maskineriet i Caenorhabditis elegans 19986 har RNAi-tekniker blivit effektiva metoder för att identifiera genfunktionen hos nematoder och föreslås som ett nytt sätt att effektivt kontrollera patogena nematoder7.
RNAi är tekniskt lättblöt ungarna i dsRNA kan räcka; Effekten och reproducerbarheten av detta tillvägagångssätt varierar dock mycket med nematodarten och målgenen8. Tystnaden av 20 gener som är involverade i RNAi-vägarna för rotknutnematoden, Meloidogyne incognita, undersöktes med långa dsRNA som utlösare, vilket resulterade i olika svar, inklusive en ökning och ingen förändring i uttrycket av vissa gener9. Dessa resultat visar att målgener kan reagera på RNAi-knockdown annorlunda, vilket kräver en uttömmande bedömning av deras lämplighet som mål för nematodkontroll via RNAi. Emellertid, Det finns för närvarande en brist på forskning om utvecklings- och reproduktionsbiologi av B. xylophilus.
Som en fortsättning på tidigare arbete10,11,12,13 beskriver vi här ett protokoll för att applicera RNAi för att studera funktionen hos ppm-1-genen hos B. xylophilus, inklusive syntesen av dsRNA, syntetisk neurostimulerande blötläggning och kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) detektion. Kunskapen från detta experimentella tillvägagångssätt kommer sannolikt att bidra markant till att förstå grundläggande biologiska system och förebygga tallviltsjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om livshistoria och parasitisk miljö av B. xylophilus skiljer sig från andra nematoder, Det har varit begränsad forskning om molekylär patogenes av denna växtpatogen. Trots stora framsteg som gjorts i tillämpningen av CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknik i C. elegans och andra nematoder, har endast RNAi-teknik som tillämpas på B. xylophilus publicerats hittills17. RNAi är ett av de mest kraftfulla verktygen som finns tillgängliga för att studera genfunktio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) och finansierades gemensamt av Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. , 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
