Vurdering af åben sandsynlighed for den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore i indstillingen af coenzym Q-overskud
Summary
Denne metode udnytter bidraget fra den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore til protonlækage med lav konduktans for at bestemme spændingstærsklen for poreåbning hos neonatale skrøbelige X-syndrommus med øget kardiomyocytmitokondrie-coenzym Q-indhold sammenlignet med vildtypekontrol.
Abstract
Den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore (mPTP) er en spændingsgated, ikke-selektiv, indre mitokondriemembran (IMM) megakanal, der er vigtig for sundhed og sygdom. mPTP medierer lækage af protoner over IMM under åbning med lav konduktans og hæmmes specifikt af ciclosporin A (CsA). Coenzym Q (CoQ) er en regulator af mPTP, og vævsspecifikke forskelle er fundet i CoQ-indhold og åben sandsynlighed for mPTP i forhjerne og hjertemitokondrier i en nyfødt musemodel af skrøbeligt X-syndrom (FXS, Fmr1 knockout). Vi udviklede en teknik til at bestemme spændingstærsklen for mPTP-åbning i denne mutante stamme og udnyttede mPTP’s rolle som en protonlækagekanal.
For at gøre dette blev iltforbrug og membranpotentiale (ΔΨ) samtidigt målt i isolerede mitokondrier ved hjælp af polarografi og en tetraphenylphosphonium (TPP+) ionselektiv elektrode under lækageåndedræt. Tærsklen for mPTP-åbning blev bestemt ved begyndelsen af CsA-medieret hæmning af protonlækage ved specifikke membranpotentialer. Ved hjælp af denne tilgang blev forskelle i spændingsgating af mPTP præcist defineret i forbindelse med CoQ-overskud. Denne nye teknik vil muliggøre fremtidig undersøgelse for at forbedre forståelsen af fysiologisk og patologisk regulering af lavledningsåbning af mPTP.
Introduction
mPTP medierer permeabilitetsovergangen (PT), hvorved IMM bliver brat gennemtrængelig for små molekyler og opløst 1,2. Dette slående fænomen er en tydelig afvigelse fra IMM’s karakteristiske uigennemtrængelighed, som er grundlæggende for at fastslå den elektrokemiske gradient, der er nødvendig for oxidativ fosforylering3. PT er i modsætning til andre mitokondrielle transportmekanismer en højkonduktans, uspecifik og ikke-selektiv proces, der tillader passage af en række molekyler op til 1,5 kDa 4,5. mPTP er en spændingsgated kanal inden for IMM, hvis åbning ændrer ΔΨ, ATP-produktion, calciumhomeostase, reaktiv iltart (ROS) produktion og cellelevedygtighed4.
Ved den patologiske ekstrem fører ukontrolleret og langvarig højkonduktansåbning af mPTP til sammenbrud af den elektrokemiske gradient, matrixhævelse, udtømning af matrixpyridinnukleotider, ydre membranbrud, frigivelse af intermembranproteiner (herunder cytokrom c) og i sidste ende celledød 4,6. En sådan patologisk mPTP-åbning har været impliceret i hjerteiskæmi-reperfusionsskade, hjertesvigt, traumatisk hjerneskade, forskellige neurodegenerative sygdomme og diabetes 1,7. MPTP-åbning med lav konduktans er imidlertid fysiologisk og fører i modsætning til åbning med høj konduktans ikke til dyb depolarisering eller mitokondriel hævelse4.
Lavledningsåbning af poren begrænser permeabiliteten til ~ 300 Da, tillader passage af protoner uafhængigt af ATP-syntese og er en potentiel kilde til fysiologisk protonlækage5. Fysiologisk mPTP-åbning forårsager et kontrolleret fald i ΔΨ, øger elektronfluxen gennem åndedrætstransportkæden og resulterer i en kort burst eller flash af superoxid, hvilket bidrager til ROS-signalering8. Regulering af en sådan forbigående mPTP-åbning er vigtig for calciumhomeostase og normal cellulær udvikling og modning 4,9,10,11. Forbigående poreåbning i udviklende neuroner udløser for eksempel differentiering, mens lukningen af mPTP inducerer modning i umodne kardiomyocytter 4,5.
Selvom den funktionelle betydning af mPTP i sundhed og sygdom er veletableret, er dens præcise molekylære identitet stadig debatteret. Fremskridtene med hensyn til mPTP’s molekylære struktur og funktion er blevet grundigt gennemgået andetsteds12. Kort fortalt er mPTP’s høj- og lavkonduktanstilstande i øjeblikket blevet antaget at være medieret af forskellige enheder12. Spidskandidaterne er F1/F0 ATP-syntasen (ATP-syntasen) og adeninnukleotidtransportøren (ANT) til henholdsvis høj- og lavledningsmodus12.
På trods af manglen på konsensus om den nøjagtige identitet af den poredannende komponent i mPTP er visse nøgleegenskaber blevet detaljeret. Et veletableret træk ved mPTP er, at det reguleres af den elektrokemiske gradient, således at depolarisering af IMM fører til poreåbning13. Tidligere arbejde har vist, at redoxtilstanden for vicinale thiolgrupper ændrer mPTP’ens spændingsgating, således at oxidation åbner poren ved relativt højere ΔΨs, og thiolgruppereduktion resulterer i lukket mPTP-sandsynlighed14. Identiteten af den proteinholdige spændingssensor er imidlertid ukendt.
Forskellige små molekyler, der modulerer porens åbne sandsynlighed, er blevet identificeret. For eksempel kan mPTP stimuleres til at åbne med calcium, uorganisk fosfat, fedtsyrer og ROS og kan hæmmes af adeninnukleotider (især ADP), magnesium, protoner og CsA 5,12. Virkningsmekanismerne for nogle af disse regulatorer er blevet belyst. Mitokondrielt calcium udløser mPTP-åbning i det mindste delvist ved at binde til β-underenheden af ATP-syntase15. ROS kan aktivere mPTP ved at reducere dets affinitet for ADP og forbedre dets affinitet for cyclophilin D (CypD), den bedst undersøgte proteinholdige mPTP-aktivator16. Mekanismen for aktivering af mPTP med uorganisk fosfat og fedtsyrer er mindre klar. Hvad angår endogene hæmmere, menes ADP at hæmme mPTP ved binding ved ANT- eller ATP-syntasen, mens magnesium udøver sin hæmmende virkning ved at fortrænge calcium fra dets bindingssted 15,17,18,19.
Lav pH hæmmer mPTP-åbningen ved protonering af histidin 112 af den regulatoriske oligomycinfølsomhedsoverledende protein (OSCP) underenhed af ATP-syntasen 12,20,21. Den prototypiske farmakologiske hæmmer af mPTP, CsA, virker ved at binde CypD og forhindre dets tilknytning til OSCP22,23. Tidligere arbejde har også vist, at en række CoQ-analoger interagerer med mPTP, hæmmer det eller aktiverer det24. I det seneste arbejde fandt vi tegn på en patologisk åben mPTP, overdreven protonlækage og ineffektiv oxidativ fosforylering på grund af en CoQ-mangel i forhjernemitokondrier hos nyfødte FXS-museunger25.
Lukning af poren med eksogen CoQ blokerede den patologiske protonlækage og inducerede morfologisk modenhed af dendritiske rygsøjler25. Interessant nok havde FXS-kardiomyocytter hos de samme dyr for høje CoQ-niveauer og lukket mPTP-sandsynlighed sammenlignet medvildtypekontroller 26. Selvom årsagen til disse vævsspecifikke forskelle i CoQ-niveauer er ukendt, understreger resultaterne konceptet om, at endogen CoQ sandsynligvis er en nøgleregulator for mPTP. Der er dog et stort hul i vores viden, fordi mekanismen for CoQ-medieret hæmning af mPTP forbliver ukendt.
Regulering af mPTP er en kritisk determinant for cellesignalering og overlevelse4. Således er detektering af mPTP-åbning inden for mitokondrier nøglen, når man overvejer specifikke patofysiologiske mekanismer. Typisk bestemmes tærsklen for poreåbning med høj konduktans ved hjælp af calcium for at udløse permeabilitetsovergangen. En sådan calciumbelastning fører til sammenbrud af membranpotentialet, hurtig afkobling af oxidativ phosphorylering og mitokondriel hævelse27,28. Vi forsøgte at udvikle en metode til at detektere mPTP-åbning med lav konduktans in situ uden at inducere den i sig selv.
Tilgangen udnytter mPTP’s rolle som en protonlækagekanal. For at gøre dette blev Clark-Type og TPP+ ionselektive elektroder anvendt til samtidig at måle henholdsvis iltforbrug og membranpotentiale i isolerede mitokondrier under lækageåndedræt29. Tærsklen for mPTP-åbning blev bestemt ved begyndelsen af CsA-medieret hæmning af protonlækage ved specifikke membranpotentialer. Ved hjælp af denne tilgang blev forskelle i spændingsgating af mPTP i forbindelse med CoQ-overskud præcist defineret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver en metode til vurdering af den åbne sandsynlighed for mPTP. Specifikt blev spændingstærsklen for mPTP-åbning med lav konduktans bestemt ved at vurdere effekten af CsA-hæmning på protonlækage over en række ΔΨ’er. Ved hjælp af denne teknik kunne vi identificere forskelle i spændingsgating af mPTP mellem FXS-mus og FVB-kontroller i overensstemmelse med deres forskelle i vævsspecifikt CoQ-indhold. Afgørende for succesen med denne metode er, at mitokondrier er friskisolerede inden brug og e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af følgende bevillinger: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost Award til Department of Anesthesiology (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) og NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
References
- Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
- Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
- Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W., Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. 14, 767-830 (2002).
- Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. 발생학. 426 (1), 1-7 (2017).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
- Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
- Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
- Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
- Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
- Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
- Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
- Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
- Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
- Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
- Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
- Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
- Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
- Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
- Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
- Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
- Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
- Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
- Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
- Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 187-196 (2018).
- Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
- Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 157-170 (2018).
- Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Moreno, A. J. . Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. , 109-119 (2018).
- Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
- Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
- Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).
