कोएंजाइम क्यू अतिरिक्त की सेटिंग में माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण पोर की खुली संभावना का आकलन
Summary
यह विधि वाइल्डटाइप नियंत्रण की तुलना में कार्डियोमायोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रियल कोएंजाइम क्यू सामग्री में वृद्धि के साथ नवजात नाजुक एक्स सिंड्रोम चूहों में ताकना खोलने के लिए वोल्टेज थ्रेशोल्ड निर्धारित करने के लिए कम-चालकता प्रोटॉन रिसाव के लिए माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र के योगदान का शोषण करती है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्र (एमपीटीपी) एक वोल्टेज-गेटेड, गैर-चयनात्मक, आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) मेगा-चैनल है जो स्वास्थ्य और बीमारी में महत्वपूर्ण है। एमपीटीपी कम चालकता खोलने के दौरान आईएमएम में प्रोटॉन के रिसाव की मध्यस्थता करता है और विशेष रूप से साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) द्वारा बाधित होता है। कोएंजाइम क्यू (सीओक्यू) एमपीटीपी का एक नियामक है, और कोक्यू सामग्री में ऊतक-विशिष्ट अंतर पाए गए हैं और नाजुक एक्स सिंड्रोम (एफएक्सएस, एफएमआर 1 नॉकआउट) के नवजात माउस मॉडल में फोरब्रेन और हृदय माइटोकॉन्ड्रिया में एमपीटीपी की खुली संभावना है। हमने इस उत्परिवर्ती तनाव में एमपीटीपी खोलने के लिए वोल्टेज थ्रेशोल्ड निर्धारित करने के लिए एक तकनीक विकसित की, जो प्रोटॉन रिसाव चैनल के रूप में एमपीटीपी की भूमिका का शोषण करती है।
ऐसा करने के लिए, ऑक्सीजन की खपत और झिल्ली क्षमता (Π) को रिसाव श्वसन के दौरान पोलरोग्राफी और टेट्राफेनिलफॉस्फोनियम (टीपीपी +) आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड का उपयोग करके पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में एक साथ मापा गया था। एमपीटीपी खोलने के लिए दहलीज विशिष्ट झिल्ली क्षमता पर प्रोटॉन रिसाव के सीएसए-मध्यस्थता निषेध की शुरुआत से निर्धारित की गई थी। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग में अंतर को सीओक्यू अतिरिक्त के संदर्भ में ठीक से परिभाषित किया गया था। यह उपन्यास तकनीक एमपीटीपी के कम चालकता उद्घाटन के शारीरिक और रोग संबंधी विनियमन की समझ को बढ़ाने के लिए भविष्य की जांच की अनुमति देगी।
Introduction
एमपीटीपी पारगम्यता संक्रमण (पीटी) की मध्यस्थता करता है, जिससे आईएमएम छोटे अणुओं के लिए अचानक पारगम्य हो जाता है और 1,2 को विलेय करता है। यह हड़ताली घटना आईएमएम की विशेषता अपारगम्यता से एक अलग प्रस्थान है, जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन3 के लिए आवश्यक इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल स्थापित करने के लिए मौलिक है। पीटी, अन्य माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन तंत्र के विपरीत, एक उच्च-चालकता, निरर्थक और गैर-चयनात्मक प्रक्रिया है, जो 1.5 केडीए 4,5 तक अणुओं की एक श्रृंखला के पारित होने की अनुमति देता है। एमपीटीपी आईएमएम के भीतर एक वोल्टेज-गेटेड चैनल है जिसका उद्घाटन Π, एटीपी उत्पादन, कैल्शियम होमियोस्टेसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन और सेल व्यवहार्यता4 को बदल देता है।
वैकृत चरम पर, एमपीटीपी के अनियंत्रित और लंबे समय तक उच्च चालकता उद्घाटन इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल, मैट्रिक्स सूजन, मैट्रिक्स पाइरिडिन न्यूक्लियोटाइड्स की कमी, बाहरी झिल्ली टूटना, इंटरमेम्ब्रेन प्रोटीन (साइटोक्रोम सी सहित) की रिहाई, और अंततः, सेल मृत्यु 4,6 के पतन की ओर जाता है। इस तरह के पैथोलॉजिकल एमपीटीपी उद्घाटन को कार्डियक इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट, दिल की विफलता, दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों और मधुमेह 1,7 में फंसाया गया है। हालांकि, कम चालकता एमपीटीपी उद्घाटन प्रकृति में शारीरिक है और, उच्च-चालकता खोलने के विपरीत, गहरा विध्रुवण या माइटोकॉन्ड्रियल सूजन4 का कारण नहीं बनता है।
छिद्र का कम चालकता उद्घाटन पारगम्यता को ~ 300 डीए तक सीमित करता है, एटीपी संश्लेषण से स्वतंत्र प्रोटॉन के पारित होने की अनुमति देता है, और शारीरिक प्रोटॉन रिसाव5 का एक संभावित स्रोत है। फिजियोलॉजिकल एमपीटीपी खोलने से Π में नियंत्रित गिरावट आती है, श्वसन परिवहन श्रृंखला के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह बढ़ता है, और इसके परिणामस्वरूप सुपरऑक्साइड का एक छोटा विस्फोट या फ्लैश होता है, जो आरओएस सिग्नलिंग 8 में योगदान देताहै। इस तरह के क्षणिक एमपीटीपी खोलने का विनियमन कैल्शियम होमियोस्टेसिस और सामान्य सेलुलर विकास और परिपक्वता 4,9,10,11 के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, विकासशील न्यूरॉन्स में क्षणिक छिद्र खोलने से भेदभाव होता है, जबकि एमपीटीपी के बंद होने से अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स 4,5 में परिपक्वता होती है।
यद्यपि स्वास्थ्य और बीमारी में एमपीटीपी का कार्यात्मक महत्व अच्छी तरह से स्थापित है, इसकी सटीक आणविक पहचान पर बहस बनी हुई है। एमपीटीपी की आणविक संरचना और कार्य पर प्रगति की व्यापक रूप से कहीं और12 समीक्षा की गई है। संक्षेप में, वर्तमान में, एमपीटीपी के उच्च और निम्न-चालकता राज्यों को अलग-अलग संस्थाओं12 द्वारा मध्यस्थता करने की परिकल्पना की गई है। एफ 0 एटीपी सिंथेस (एटीपी सिंथेस) और एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रांसपोर्टर (एएनटी) क्रमशः उच्च और निम्न-चालकता मोड के लिए हैं।
एमपीटीपी के छिद्र बनाने वाले घटक की सटीक पहचान के बारे में आम सहमति की कमी के बावजूद, कुछ प्रमुख विशेषताओं को विस्तृत किया गया है। एमपीटीपी की एक अच्छी तरह से स्थापित विशेषता यह है कि इसे इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट द्वारा विनियमित किया जाता है जैसे कि आईएमएम के विध्रुवण से छिद्र खुलने की ओर जाता है13। पहले के काम से पता चला है कि विसिनल थिओल समूहों की रेडॉक्स स्थिति एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग को बदल देती है, जैसे कि ऑक्सीकरण अपेक्षाकृत उच्च ππs पर छिद्र खोलता है, और थिओल समूह में कमी के परिणामस्वरूप बंद एमपीटीपी संभावना14 होती है। हालांकि, प्रोटीनमय वोल्टेज सेंसर की पहचान अज्ञात है।
विभिन्न छोटे अणु जो छिद्र की खुली संभावना को संशोधित करते हैं, उनकी पहचान की गई है। उदाहरण के लिए, एमपीटीपी को कैल्शियम, अकार्बनिक फॉस्फेट, फैटी एसिड और आरओएस के साथ खोलने के लिए उत्तेजित किया जा सकता है और एडेनिन न्यूक्लियोटाइड्स (विशेष रूप से एडीपी), मैग्नीशियम, प्रोटॉन और सीएसए 5,12 द्वारा बाधित किया जा सकता है। इनमें से कुछ विनियामकों की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट किया गया है। माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम एटीपी सिंथेस15 के β-सबयूनिट को बाध्य करके कम से कम भाग में एमपीटीपी खोलने को ट्रिगर करता है। आरओएस एडीपी के लिए अपनी आत्मीयता को कम करके और साइक्लोफिलिन डी (सीवाईपीडी) के लिए अपनी आत्मीयता को बढ़ाकर एमपीटीपी को सक्रिय कर सकता है, जो सबसे अच्छा अध्ययन किया गया प्रोटीनियस एमपीटीपी एक्टिवेटर16 है। अकार्बनिक फॉस्फेट और फैटी एसिड द्वारा एमपीटीपी के सक्रियण का तंत्र कम स्पष्ट है। अंतर्जात अवरोधकों के लिए, एडीपी को एएनटी या एटीपी सिंथेस पर बाध्यकारी द्वारा एमपीटीपी को बाधित करने के लिए सोचा जाता है, जबकि मैग्नीशियम अपनी बाध्यकारी साइट15,17,18,19 से कैल्शियम को विस्थापित करके अपने निरोधात्मक प्रभाव को लागू करता है।
कम पीएच एटीपी सिंथेस 12,20,21 के नियामक ओलिगोमाइसिन संवेदनशीलता-प्रदान प्रोटीन (ओएससीपी) सबयूनिट के हिस्टिडाइन112 को प्रोटॉन करके एमपीटीपी खोलने को रोकता है। एमपीटीपी, सीएसए का प्रोटोटाइपिकल फार्माकोलॉजिकल अवरोधक, सीवाईपीडी को बाध्य करके और ओएससीपी22,23 के साथ इसके सहयोग को रोककर कार्य करता है। पिछले काम से यह भी पता चला है कि विभिन्न प्रकार के कोक्यू एनालॉग एमपीटीपी के साथ बातचीत करते हैं, इसे बाधित करते हैं या इसे सक्रिय करते हैं24। हाल के काम में, हमें नवजात एफएक्सएस माउस पिल्ले25 के अग्रमस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया में सीओक्यू की कमी के कारण पैथोलॉजिकल रूप से खुले एमपीटीपी, अत्यधिक प्रोटॉन रिसाव और अक्षम ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के सबूत मिले।
बहिर्जात सीओक्यू के साथ छिद्र के बंद होने से वैकृत प्रोटॉन रिसाव और डेंड्रिटिक स्पाइन25 की प्रेरित आकारिकी परिपक्वता को अवरुद्ध कर दिया गया। दिलचस्प बात यह है कि एक ही जानवरों में, एफएक्सएस कार्डियोमायोसाइट्स में वाइल्डटाइप नियंत्रण26 की तुलना में अत्यधिक सीओक्यू स्तर और बंद एमपीटीपी संभावना थी। यद्यपि सीओक्यू स्तरों में इन ऊतक-विशिष्ट मतभेदों का कारण अज्ञात है, निष्कर्ष इस अवधारणा को रेखांकित करते हैं कि अंतर्जात सीओक्यू संभवतः एमपीटीपी का एक प्रमुख नियामक है। हालांकि, हमारे ज्ञान में एक बड़ा अंतर है क्योंकि एमपीटीपी के सीओक्यू-मध्यस्थता निषेध का तंत्र अज्ञात रहता है।
एमपीटीपी का विनियमन सेल सिग्नलिंग और अस्तित्व4 का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है। इस प्रकार, विशिष्ट पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र पर विचार करते समय माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर एमपीटीपी खोलने का पता लगाना महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, पारगम्यता संक्रमण को ट्रिगर करने के लिए कैल्शियम का उपयोग करके उच्च-चालकता छिद्र खोलने के लिए दहलीज निर्धारित की जाती है। इस तरह के कैल्शियम लोडिंग झिल्ली क्षमता के पतन, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के तेजी से अनकपलिंग, और माइटोकॉन्ड्रियल सूजन27,28 की ओर जाता है। हमने सीटू में कम-चालकता एमपीटीपी खोलने का पता लगाने के लिए एक विधि विकसित करने की मांग की, इसे प्रति से प्रेरित किए बिना।
दृष्टिकोण एक प्रोटॉन रिसाव चैनल के रूप में एमपीटीपी की भूमिका का शोषण करता है। ऐसा करने के लिए, क्लार्क-टाइप और टीपीपी + आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड को रिसाव श्वसन29 के दौरान पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में क्रमशः ऑक्सीजन की खपत और झिल्ली क्षमता को एक साथ मापने के लिए नियोजित किया गया था। एमपीटीपी खोलने के लिए दहलीज विशिष्ट झिल्ली क्षमता पर प्रोटॉन रिसाव के सीएसए-मध्यस्थता निषेध की शुरुआत से निर्धारित की गई थी। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, सीओक्यू अतिरिक्त के संदर्भ में एमपीटीपी के वोल्टेज गेटिंग में अंतर को ठीक से परिभाषित किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर एमपीटीपी की खुली संभावना का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विशेष रूप से, कम चालकता एमपीटीपी खोलने के लिए वोल्टेज थ्रेशोल्ड को प्रोटॉन रिसाव पर सीएसए अवरोध के प्रभाव का आकलन करके निर्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया है: एनआईएच / एनआईजीएमएस टी 32 जीएम 008464 (केकेजी), कोलंबिया विश्वविद्यालय इरविंग मेडिकल सेंटर एनेस्थिसियोलॉजी विभाग (केकेजी), सोसाइटी ऑफ पीडियाट्रिक एनेस्थेसिया यंग इन्वेस्टिगेटर रिसर्च अवार्ड (केकेजी), और एनआईएच / एनआईएच / एनआईएनडीएस आर 01 एनएस 112706 (आरजेएल) के समाज को अवसर प्रोवोस्ट पुरस्कार का लक्ष्य
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 15630080 | |
| Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 | PP systems | 941039 | |
| BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. | Fisher Scientific | 14-170-11B | to modify the length of the hamilton synringe as needed |
| Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free | Sigma | A7030-10G | |
| Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm | World Precision Inst. LLC | DRIREF-2 | |
| Electrode Holder for KWIK-Tips | World Precision Inst. LLC | KWIK-2 | ion selective electrode holder |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 324626 | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FXS mice, Fmr1 KO | |
| FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | FVB mice | |
| Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk | Cole-Parmer | EW-07938-30 | microsyringe |
| Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle | Cole-Parmer | EW-07938-02 | microsyringe |
| Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete | PP systems | OXYTHERM+R | oxygen electrode and software |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | 1374248 | |
| Mannitol | Sigma | M9546-250G | |
| P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) | Sigma | D4022-10MG | |
| Percoll | Sigma | P1644 | medium for density gradient separation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P3911 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma | 5.43841 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| TPP+ Electrode Tips (3) | World Precision Inst. LLC | TIPTPP |
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