Ett höghastighets och öppet ultraviolett fotoakustiskt mikroskop som kan tillhandahålla histologiska bilder intraoperativt för kirurgisk marginalanalys demonstreras, inklusive systemkonfiguration, optisk inriktning, provberedning och experimentella procedurer.
Kirurgisk marginalanalys (SMA), ett viktigt förfarande för att bekräfta fullständig excision av cancervävnad vid tumörresektionskirurgi, kräver intraoperativa diagnostiska verktyg för att undvika upprepade operationer på grund av en positiv kirurgisk marginal. Nyligen, genom att dra nytta av den höga inneboende optiska absorptionen av DNA / RNA vid 266 nm våglängd, har ultraviolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utvecklats för att ge högupplösta histologiska bilder utan märkning, vilket visar stort löfte som ett intraoperativt verktyg för SMA. För att möjliggöra utvecklingen av UV-PAM för SMA presenteras här ett höghastighets- och öppet UV-PAM-system som kan användas på samma sätt som konventionella optiska mikroskopior. UV-PAM-systemet ger en hög sidoupplösning på 1,2 μm och en hög bildhastighet på 55 kHz A-linjehastighet med enaxlig galvanometerspegelskanning. Dessutom, för att säkerställa att UV-PAM-bilder enkelt kan tolkas av patologer utan ytterligare utbildning, är de ursprungliga gråskala UV-PAM-bilderna praktiskt taget färgade av en djupinlärningsalgoritm för att efterlikna de vanliga hematoxylin- och eosinfärgade bilderna, vilket möjliggör träningsfri histologisk analys. Mushjärnskivavbildning utförs för att visa den höga prestandan hos det öppna UV-PAM-systemet, vilket illustrerar dess stora potential för SMA-applikationer.
Kirurgisk marginalanalys (SMA), som kräver en undersökning av vävnadsprover under ett mikroskop, är ett viktigt förfarande för att avgöra om alla cancerceller tas bort från en patients kropp i en resektionsoperation1. Därför är ett mikroskop som snabbt kan ge histologiska bilder mycket viktigt för SMA för att undvika upprepade operationer orsakade av ofullständig borttagning av cancerceller. Enligt den nuvarande guldstandardmetoden baserad på ljusfältsoptisk mikroskopi måste emellertid den exciserade vävnaden fixeras i formalin, inbäddad i paraffin, delas upp i tunna skivor (4-7 μm) och sedan färgas av hematoxylin och eosin (H & E) före avbildning, vilket är tidskrävande (3-7 dagar) ochmödosamt 2,3 . En frusen sektion är ett snabbt alternativ för SMA genom att snabbt frysa, skära och färga vävnaden, vilket kan ge histologiska bilder på 20-30 min4. De histologiska egenskaperna är emellertid ofta förvrängda och kräver skicklig träning, vilket hindrar teknikens tillämplighet på flera typer av organ5.
Optiska mikroskopitekniker som kan ge cellulära bilder utan eller med några steg av vävnadsbehandling har utvecklats för SMA. Men var och en av dem lider av olika problem. Till exempel lider optisk koherenstomografi6 och konfokal reflektansmikroskopi7 av låg specificitet på grund av deras låga inneboende spridningskontrast. Även om mikroskopi med ultraviolett yt excitation8 och ljusarkmikroskopi9 kan ge högupplösta och högkontrastbilder för SMA, kan den giftiga och flyktiga färgningen vanligtvis inte utföras i en operationssal, vilket förlänger vändningstiden. Multifotonmikroskopi10 och stimulerad Raman-mikroskopi11 kan ge rik information för SMA. Ändå förhindrar den höga kostnaden för de nödvändiga ultrasnabba lasrarna som används för att generera olinjära effekter deras breda tillämplighet.
Nyligen, genom att dra nytta av inneboende optisk absorption, har etikettfri ultraviolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utvecklats för att ge högupplösta histologiska bilder12. I UV-PAM absorberas fotonenergin i excitations-UV-ljuset (t.ex. 266 nm) först av DNA / RNA i cellkärnor13 och omvandlas sedan till värme, vilket inducerar akustisk vågemission genom termisk elastisk expansion14. Genom att detektera de genererade akustiska vågorna kan tvådimensionella (2D) UV-PAM-bilder av cellkärnor erhållas via maximal amplitudprojektion av de akustiska signalerna, vilket ger histologisk information för SMA. För att möjliggöra kliniska tillämpningar av UV-PAM har höghastighets UV-PAM baserat på galvanometerspegelskanning utvecklats för att ge histologiska bilder för ett hjärnbiopsiprov (5 mm x 5 mm) inom 18 minuter, vilket visar stor potential i tidskänsliga applikationer15. För att ytterligare validera möjligheten till UV-PAM för tjockvävnadsavbildning föreslogs ett reflektionsläge UV-PAM-system med en vattentät enaxlig mikroelektromekanisk systemskanner, som framgångsrikt demonstrerade intraoperativ histopatologisk undersökning av mänskliga kolon- och levervävnader16. Eftersom den ursprungliga UV-PAM-bilden är i gråskala medan den gyllene H&E-färgade bilden är i rosa och lila färger är det svårt för patologer att tolka UV-PAM-bilder direkt. För att lösa problemet föreslogs en djupinlärningsalgoritm för att överföra GRÅSKALA UV-PAM-bilder till virtuella H & E-färgade bilder i nästan realtid så att patologer kan förstå bilderna utan ytterligare utbildning17.
Detta arbete rapporterar ett höghastighets och öppet UV-PAM-system som kan användas på samma sätt som konventionella optiska mikroskopior, vilket ger både ursprungliga gråskale histologiska bilder och praktiskt taget färgade bilder med hjälp av en djupinlärningsalgoritm. En formalin-fixerad och paraffininbäddad (FFPE) mushjärnskiva avbildas av UV-PAM-systemet för att visa likheten mellan våra praktiskt taget färgade UV-PAM och vanliga H &E-färgade bilder, vilket visar dess potential för SMA-applikationer.
Sammanfattningsvis har ett höghastighets- och öppet UV-PAM-system demonstrerats för histologisk avbildning. De detaljerade instruktionerna om systemkonfiguration, optisk inriktning, provberedning och experimentella procedurer presenteras. Bildförvärvsprogrammet kan nås från Github via länken i materialförteckningen. Den laterala upplösningen av det nuvarande systemet är ~ 1,2 μm som experimentellt har mätts i en ny publikation21. En mushjärnskiva avbildades för att visa att det nuvarande systemet kan få en histologisk bild inom 18 minuter för ett område på 5 x 5 mm2, vilket är en typisk storlek på hjärnbiopsi22. Även om den ursprungliga bilden är i gråskala, med hjälp av ett digitalt virtuellt färgningsverktyg som möjliggörs av en djupinlärningsalgoritm, kan det nuvarande systemet ytterligare tillhandahålla praktiskt taget färgade bilder i nästan realtid, vilket säkerställer enkel anpassning för patologer att tolka bilderna. Som en etikettfri bildteknik kan det nuvarande UV-PAM-systemet också tillhandahålla histologiska bilder för obearbetade färska vävnadsprover. Fler exempel (inklusive frysta och färska vävnadsprover) har visats i en tidigare publikation17. De experimentella resultaten visar den höga potentialen hos det nuvarande djupinlärningsassisterade UV-PAM-systemet i SMA-applikationer.
En av fördelarna med UV-PAM-systemet är att systemet implementeras i reflektionsläge, vilket möjliggör avbildning av tjocka vävnader. Dessutom tillåter det öppna UV-PAM-systemet att provet placeras på skanningsfönstret (provtankens membran), som har en liknande funktion som traditionella optiska mikroskopior. Därför är detta system mer användarvänligt än andra system som kräver att prover klämmers in av två membran11,14. Dessutom, genom att använda en 1D GM med en UV-laser med hög repetitionshastighet, kan det nuvarande UV-PAM-systemet uppnå hög bildhastighet med högre kostnadseffektivitet jämfört med systemet som använder multifokal excitation23.
För närvarande är bildhastigheten huvudsakligen begränsad av laser- och fotonbudgetens repetitionshastighet. Med en laser som har en hög repetitionshastighet och hög pulsenergi kan avbildningstiden förkortas ytterligare. En annan begränsning av systemet är att provet endast kan justeras grovt till objektivlinsens fokalplan genom att hitta de maximala PA-signalerna, istället för att visa en realtidsbild för användare att visualisera om provet är i fokus. För att visa en bild i nära realtid kan 2D GM tillämpas.
Det finns två kritiska steg i protokollet: a) Det konfokala kravet på optiska och akustiska fokusområden bör optimeras för att uppnå en hög detektionskänslighet. b) Skanningsområdet för den genetiskt modifierade produkten på x-axeln bör vara mindre än den akustiska brännpunkten för den ringformade UT för att bibehålla liknande hög detektionskänslighet (i den aktuella inställningen är skanningsområdet ~ 30 μm ±15 μm). Annars skulle uppenbara vinjetteringseffekter runt kanterna uppstå när flera underbilder sys ihop för att få en hel bild.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uppmärksamma det ekonomiska stödet från Hongkongs innovations- och teknikkommission (ITS/036/19).
Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |