Method Article

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

DOI:

10.3791/63651

⸱

March 28th, 2022

 , 
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 망막으로부터 수득된 뮐러 글리아 일차 배양물은 마이크로RNA 처리 후 망막 전구 세포로의 신경교세포 전환을 연구하는 매우 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다. 단일 분자 또는 조합물은 생체내 접근법의 후속 적용 전에 시험될 수 있다.

Abstract

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뮐러 글리아 (MG)는 신경 망막에서 우세한 아교 세포이며 망막 뉴런의 재생 원으로 기능 할 수 있습니다. 물고기와 같은 하부 척추 동물에서는 MG 구동 재생이 자연적으로 발생합니다. 그러나 포유류에서는 특정 요인에 대한 자극이나 유전 적 / 후성 유전 적 조작이 필요합니다. MG는 망막 세포 집단의 단지 5%만을 구성하기 때문에, 이 세포 집단의 연구를 배타적으로 허용하는 모델 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 모델 시스템 중 하나는 재현 가능한 일차 MG 배양물이며 분자/인자 스크리닝 및 식별, 화합물 또는 인자 테스트, 세포 모니터링 및/또는 기능 테스트를 포함한 다양한 용도에 사용할 수 있습니다. 이 모델은 인공 miRNA 또는 그의 억제제의 형질감염을 통해 마이크로RNA (miRNAs)의 보충 또는 억제 후에 망막 뉴런으로 전환하는 뮤린 MG의 잠재력을 연구하는 데 사용된다. MG 특이적 리포터 마우스를 면역형광 표지 및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 병용하여 이들 배양물에서 발견된 세포의 80%-90%가 MG임을 확인하였다. 이 모델을 사용하여 miRNA는 MG를 망막 전구 세포(RPCs)로 재프로그래밍할 수 있으며, 이는 이어서 신경유사 세포로 분화된다. 이 기술의 장점은 miRNA 후보가 생체 내 적용에서 사용하기 전에 효율성과 결과에 대해 테스트 할 수 있다는 것입니다.

Introduction

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뮐러 글리아교(MG)는 신경망막에서 우세한 신경교세포입니다. 그들은 물과 이온 항상성 유지, 뉴런 영양 공급 및 조직 보호와 같은 중추 신경계의 다른 부위의 다른 아교세포에 비해 유사한 기능을 가지고 있습니다. MG는 또 다른 매혹적인 특징을 가지고 있습니다 : 성숙한 아교 세포이지만 발달 후반 동안 망막 전구 세포 (RPC)에서 발현되는 많은 유전자를 여전히 발현합니다 1,2. 이러한 유사성은 망막 손상 후 어망막에서 자연적으로 발생하는 MG계 신경세포 재생의 원인으로 가정된다3,4. 이 과정 동안, MG는 세포 주기에 다시 들어가고 RPC로 탈분화된 다음, 여섯 가지 유형의 망막 뉴런으로 분화된다. 이 현상은 물고기에서 자연적으로 발생하지만, 포유류 MG는 뉴런 5,6으로 변환되지 않습니다. 그러나 다시 프로그래밍 할 수 있습니다. MG를 RPC / 뉴런으로 재 프로그래밍하는 다양한 요인이 나타났습니다. 이들 인자 중에는 어류 재생 <....

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Protocol

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동물 피험자와 관련된 절차는 SUNY 검안 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

참고: 이 배양 프로토콜은 성장, 형질감염 및 전환 단계의 세 단계로 구성됩니다. 타임라인이 있는 전체 프로토콜에 대한 요약은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 배지 및 모든 필수 시약의 제조

참고: 모든 단계는 A2 또는 B2 생물안전 캐비닛(BSC)에서 수행해야 합니다. 성장 단계 동안, 표피 성장 인자 (EGF)로 보충된 기초 뉴런 배지로 구성되는 고혈청 성장 배지가 사용된다. 전환 단계의 경우, 신경 보충제가 보충 된 저혈청 신경 생리 학적 기본 배지가 신경 분화 및 생존을 보장하는 데 사용됩니다.

  1. 기저 신경배지 200mL에 소 혈청 20mL(FBS, 10%), 200mM L-글루타민 1mL(0.5%), 페니실린/스트렙토마이신 2mL(1%), N2 보충제 2mL(1%)를 보충하여 성장 배지(성장기 동안 사용)를 준비합니다. 멸균 여과(0.22μm 기공 크기를 갖는 필터 장치)를....

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Results

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이 프로토콜은 P12 마우스 망막에서 MG를 성장시키는 방법과 Ascl1CreERT : tdTomatoSTOPfl / fl RPC 리포터 마우스를 사용하여 miR-25로 이러한 세포를 망막 뉴런으로 재 프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 MG를 RPC로 재프로그래밍한 다음, 뉴런 세포 특성(27)을 채택하기 위해 다른 적합한 miRNA(모방체 또는 억제제, 단일 분자 또는 조합)를 상세히 보고하기 위한 이전 연구에서 사용되었다. 이 방법은 배양물을 더 빠르게 성장시키고, 따라서 시간24,28,29에 걸쳐 인공 환경에 의해 야기되는 세포 변화를 최소화하도록 변형되었다.

원발성 MG 배양의 망막 해.......

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Discussion

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이 프로토콜은 miRNAs를 이용한 리프로그래밍 연구를 위해 해리된 마우스 망막으로부터 MG를 성장시키는 방법을 기술한다. 다양한 이전 연구에서 보여지고 확인 된 바와 같이, 이들 배양물에서 발견되는 세포의 대다수 (80 % -90 %)는 MG20,23,24입니다. 이 방법은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 기술이며 프로토콜을 올바르게 준수하면 결과를 쉽게 재현 할 수 있습니다21,27. 그러나 문화의 성공적인 성장과 재 프로그래밍 효율성은 다양한 요인에 달려 있습니다.

첫째, 마우스의 나이는 성공적인 세포 성장에 중요한 역할을합니다. 따라서, MG 배양물이 리포터 마우스와 같은 야생형과 유사한 야생형 마우스 또는.......

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Disclosures

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이 보고서의 결과 중 일부를 포함한 특허는 워싱턴 대학에서 발명가 Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl 및 Thomas A. Reh와 함께 제출했습니다. 이 특허의 제목은 '망막 재생을 자극하는 방법 및 조성물.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 Ann Beaton 박사와 모든 실험실 구성원에게 원고에 대한 의견에 감사드립니다. 시애틀의 워싱턴 대학에서 박사 후 교육 기간 동안 MG 일차 문화를 S.G.W.에 선별 도구로 소개 한 Tom Reh, Julia Pollak 및 Russ Taylor 박사에게 특별한 감사를드립니다. 이 연구는 S.G.W.에 대한 엠파이어 이노베이션 프로그램 (EIP) 그랜트와 SUNY Optometry에서 S.G.W.까지의 스타트업 펀드와 National Eye Institute (NEI)에서 S.G.W.에 이르는 R01EY032532 어워드의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT 마우스 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT 마우스와 tdTomato 마우스
tdTomato-STOPfl/fl 마우스를 교배했습니다. 나6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / JJax laboratories# 007914유전형 분석은 Ascl1CreER 양성 마우스를 식별하는 데 필요합니다
시약< / strong>
(Z) -4-Hydroxytamoxifen, ≥ 98% Z 이성질체Sigma-AldrichH7904-5MG에탄올, 냉동 분취액으로 재구성
16% 파라포름알데히드(PFA) 수용액VWR100504-782인산염 완충 식염수(PBS)로 만든 2% PFA, 냉동 분취
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152희석 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147희석 1:500
Anti-human Otx2 항체, R& D SystemsFisher ScientificAF1979희석 1:500
안티 토끼 MAP2 항체Sigma-AldrichM9942-200UL희석 1:250
안티 적색 형광 단백질(RFP) 항체항체-온라인ABIN334653희석 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132PBS에서 재구성, 냉동 분취
B-27 보충제Fisher Scientific17-504-044냉동 부분 표본
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790섹션 1.2에서 뉴런 배지로 사용, 4°C에 보관; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB
)Click-iT EdU Alexa Fluor 647 이미징 키트Fisher ScientificC10340재구성 다음 매뉴얼, 4&데그; C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886Dimethyl sulfoxide (DMSO), 냉동 분취
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CV냉동 분량
Gibco  Opti-MEM 감소 세럼 매체, GlutaMAX 보충제Fisher Scientific51-985-0344 °에 저장; C
깁코  트립신을 함유하는 용액으로 사용되는 TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드Fisher Scientific12-605-028, 4°C에서 보관; C
HBSSFisher Scientific14-025-1344 °에 저장; C
라미닌 마우스 단백질, 천연Fisher Scientific23-017-015

냉동 부분 표본, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
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KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081냉동 분취량
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50RNase free water (200 µ M), 냉동 분취량
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050RNase free water (200 µ M), 냉동 분취제
N-2 보충제Fisher Scientific17-502-048냉동 분취
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049섹션 1.1에서 성장 배지로 사용, 4 °에 보관; C
파파인 해리 시스템Worthington BiochemicalLK003153Earle's Balanced Salt Solution, 냉동 부분 표본으로 재구성
페니실린 스트렙토마이신Fisher Scientific15-140-122냉동 분취액
인산염 완충 식염수(PBS)Fisher Scientific20-012-043
폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드시그마-알드리치P4538-50MG멸균수, 냉동 분취 표본에서 재구성
재조합 인간 BDNF 단백질R& D Systems248-BDB-050/CF멸균된 PBS 및 FBS, 냉동 분취액에서 재구성됨
재조합 마우스 EGF 단백질Fisher Scientific2028EG200은 멸균된 PBS, 냉동 분취액에서
재조합 쥐 GDNF 단백질Fisher Scientific512GF010은 멸균된 PBS, 냉동 분취액에서 재구성되었습니다.
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150희석 1:1,000
슬라이드 장착 매체Fisher ScientificOB100-01
형질주입 시약(Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL30000154°E에 보관; C
plasticware/supplies
0.6 mL 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific50-408-120
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific50-408-129
10 µ L 팁  멸균 필터  피펫 팁Fisher Scientific02-707-439
100 µ L 팁  멸균 필터 피펫 팁Fisher Scientific02-707-431
1000 &마이크로; L TIP 멸균 필터 피펫 팁Fisher Scientific02-707-404
2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific50-408-138
20 µ L 팁  멸균 필터 피펫 팁Fisher Scientific02-707-432
조절 가능한 볼륨 피펫(2.5, 10, 20, 100, 200 & 1000 & 마이크로; L)Eppendorf2231300008
일회용 전사 PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  멸균 필터 10ML 일회용 혈청학 PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  멸균 필터 50ML 일회용 혈청학적 PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  멸균 필터 5ML 일회용 혈청학적 PipetsFisher Scientific13-676-10H
파우더-프리 니트릴 검사 장갑Fisher Scientific19-130-1597B
원형 커버슬립 (직경 12mm, 두께 0.17 - 0.25mm)Fisher Scientific22293232
진공 필터, 기공 크기=0.22 &마이크로; mFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
올인원 형광 현미경 Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
쌍안 줌 스테레오 현미경Vision ScientificVS-1EZ-IFR07
일회용 페트리 접시 (직경 100 mm)VWR25384-088
Dumont #5 집게 - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 집게 - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 곡선 집게 - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf
파인 가위-샤프파인 사이언스 도구14058-11
McPherson-Vannas 가위, 8cm세계 정밀 기기14124
금속 구슬 목욕실험실 갑옷74309-714
너트 믹서, 전기=115V, 60Hz, 속도=24rpmVWR82007-202
실리콘 코팅 해부 페트리 접시(90mm 직경)리빙 시스템 계측DD-ECON-90-BLK-5PK
핀셋, 경제 #5세계 정밀 기기501979
워터 재킷 CO2 인큐베이터VWR10810-744
액 은 액 로 재구성되었습니다. 수 는 재구성됨 2231000508

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcript....

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Muller GliaPrimary Cell CultureMicroRNA TreatmentRetinal Progenitor CellsRetinal RegenerationImmunofluorescent LabelingSingle Cell RNA SequencingNeuronal DifferentiationCell TransfectionRegenerative Medicine

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