Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung
Summary
Müller-Glia-Primärkulturen, die aus Mausnetzhaut gewonnen werden, stellen ein sehr robustes und zuverlässiges Werkzeug dar, um die Umwandlung von Gliazellen in retinale Vorläuferzellen nach einer microRNA-Behandlung zu untersuchen. Einzelne Moleküle oder Kombinationen können vor der anschließenden Anwendung von In-vivo-Ansätzen getestet werden.
Abstract
Müller-Glia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut und können als regenerative Quelle für retinale Neuronen fungieren. Bei niederen Wirbeltieren wie Fischen findet die MG-getriebene Regeneration auf natürliche Weise statt; Bei Säugetieren ist jedoch eine Stimulation mit bestimmten Faktoren oder eine genetische/epigenetische Manipulation erforderlich. Da MG nur 5% der retinalen Zellpopulation ausmachen, besteht ein Bedarf an Modellsystemen, die ausschließlich die Untersuchung dieser Zellpopulation ermöglichen. Eines dieser Modellsysteme sind primäre MG-Kulturen, die reproduzierbar sind und für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, einschließlich Molekül- / Faktor-Screening und -Identifizierung, Testen von Verbindungen oder Faktoren, Zellüberwachung und / oder Funktionstests. Dieses Modell wird verwendet, um das Potenzial von murinem MG zu untersuchen, sich nach Supplementierung oder Hemmung von microRNAs (miRNAs) durch Transfektion künstlicher miRNAs oder ihrer Inhibitoren in retinale Neuronen umzuwandeln. Die Verwendung von MG-spezifischen Reportermäusen in Kombination mit Immunfluoreszenzmarkierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bestätigte, dass 80% -90% der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG sind. Mit diesem Modell wurde entdeckt, dass miRNAs MG in retinale Vorläuferzellen (RPCs) umprogrammieren können, die sich anschließend in neuronale Zellen differenzieren. Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass miRNA-Kandidaten vor ihrer Verwendung in In-vivo-Anwendungen auf ihre Effizienz und ihr Ergebnis getestet werden können.
Introduction
Die Müllerglia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut. Sie haben ähnliche Funktionen im Vergleich zu anderen Gliazellen in anderen Teilen des zentralen Nervensystems, wie z.B. die Aufrechterhaltung der Wasser- und Ionenhomöostase, die Ernährung von Neuronen und den Schutz des Gewebes. MG haben eine weitere faszinierende Eigenschaft: Obwohl sie reife Gliazellen sind, exprimieren sie immer noch viele Gene, die in retinalen Vorläuferzellen (RPCs) während der späten Entwicklung exprimiertwerden 1,2. Es wird angenommen, dass diese Ähnlichkeit der Grund für die natürlich vorkommende MG-basierte neuronale Regeneration in der Netzhaut der Fische nach Netzhautschädenist 3,4. Während dieses Prozesses tritt MG wieder in den Zellzyklus ein und dedifferenziert sich in RPCs, die sich dann in alle sechs Arten von Netzhautneuronen differenzieren. Obwohl dieses Phänomen natürlich bei Fischen auftritt, wandeln sich MG von Säugetieren nicht in Neuronenum 5,6. Sie können jedoch umprogrammiert werden. Es wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Faktoren MG in RPCs / Neuronen umprogrammiert; Zu diesen Faktoren gehört der grundlegende Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der an der Fischregeneration beteiligt ist 7,8. Bei Mäusen wird Ascl1 während der Retinogenese nur in RPCs exprimiert, fehlt jedoch in reifen MG- oder retinalen Neuronen9.
Die direkte Reprogrammierung von Zellen in vivo ist nicht nur eine methodische Herausforderung, sondern erfordert auch die Genehmigung eines institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung. Um die Zulassung zu erhalten, sind vorläufige Daten über die verwendeten oder veränderten Faktoren, Konzentrationen, Off-Target-Effekte, zugrunde liegende Mechanismen, Toxizität und Effizienz erforderlich. Zellkultursysteme ermöglichen es, diese Kriterien vor der Verwendung in In-vivo-Modellen zu testen. Da MG nur etwa 5% der gesamten retinalen Zellpopulationausmachen 10, ermöglichen MG-Kulturen die Untersuchung ihrer Funktion 11 sowie ihres Verhaltens, einschließlich Migration 12,13, Proliferation 14, Stressreaktion auf Verletzungen/Schäden15,16, ihrer Interaktion mit anderen Zelltypen wie Mikroglia 17 oder retinalen Ganglienzellen (RGCs)18, oder ihr neurogenes Potential 19,20,21. Viele Forscher verwenden immortalisierte Zelllinien für ihre Studien, da sie ein unbegrenztes proliferatives Potenzial haben und leicht aufrechterhalten und transfiziert werden können. Primärzellen sind jedoch für biologisch relevante Assays besser geeignet als unsterbliche Zellen, da sie echte Zelleigenschaften (Gen- und Proteinexpression) aufweisen und, was noch wichtiger ist, ein bestimmtes Entwicklungsstadium darstellen und daher ein “Alter” haben. Das Alter eines Tieres (und folglich der von einem Tier gewonnenen Zellen) ist ein besonders entscheidender Faktor bei der zellulären Reprogrammierung, da die Zellplastizität mit fortschreitendem Entwicklungsstadium abnimmt22.
Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie primäres MG mit miRNAs als aktuelle In-vitro-Methode zur Untersuchung der Regeneration umprogrammiert werden kann. Dieses MG-Primärkulturmodell wurde 2012 etabliert, um die Zellproliferationseigenschaften von MG in P53-Knock-out-Mäusen (trp53-/- Mäuse)23 zu bewerten. Es wurde gezeigt, dass kultivierte MG ihre Gliaeigenschaften beibehalten (d. h. Expression von S100β-, Pax6- und Sox2-Proteinen, die über Immunfluoreszenzmarkierung bewertet werden) und dass sie in vivo MG (Microarray of FACS-gereinigtem MG)23 ähneln. Kurz darauf wurden gliale mRNA und Proteinexpression validiert und in einem anderen Ansatz mit viralen Vektorenbestätigt 20. Einige Jahre später wurde bestätigt, dass die überwiegende Mehrheit der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG ist, indem die MG-spezifische Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl Reportermaus24 verwendet wurde. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Satzes von miRNAs sowohl in FACS-gereinigtem MG als auch in kultiviertem primärem MG, dass die Spiegel von MG-miRNAs (mGLiomiRs) in kultiviertem MG während der Wachstumsphase nicht sehr unterschiedlich sind. Verlängerte Kulturperioden verursachen jedoch Veränderungen der miRNA-Spiegel und folglich der mRNA-Spiegel und der Proteinexpression, da miRNAs translationale Regulatorensind 25.
Im Jahr2013 wurde dieses MG-Kulturmodell verwendet, um eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren in Bezug auf ihre Fähigkeit zu testen, MG in retinale Neuronen 20 umzuprogrammieren. Ascl1 erwies sich als sehr robuster und zuverlässiger Reprogrammierungsfaktor. Die Überexpression von Ascl1 über virale Vektoren induzierte morphologische Veränderungen, die Expression neuronaler Marker und den Erwerb neuronaler elektrophysiologischer Eigenschaften. Noch wichtiger ist, dass die Erkenntnisse und Ergebnisse aus diesen ersten In-vitro-Experimenten erfolgreich auf In-vivo-Anwendungenübertragen wurden 22,26, die zeigen, dass primäre MG-Kulturen ein solides und zuverlässiges Werkzeug für anfängliche Faktor-Screenings und die Bewertung von Glia-Merkmalen vor der In-vivo-Implementierung darstellen.
Vor einigen Jahren wurde gezeigt, dass die mit dem Gehirn angereicherte miRNA miR-124, die auch in retinalen Neuronen hoch exprimiert wird, die Ascl1-Expression in kultiviertem MG21 induzieren kann. Die Ascl1-Expression in lebenden Zellen wurde über eine Ascl1-Reportermaus (Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl) visualisiert. Eine Reportermaus ist eine gentechnisch veränderte Maus, in deren DNA ein Reportergen eingefügt wurde. Dieses Reporter-Gen kodiert für ein Reporterprotein, das in dieser Studie tdTomato, ein rot fluoreszierendes Protein, ist. Dieses Reporterprotein berichtet über die Expression eines Gens von Interesse, in diesem Fall Ascl1. Mit anderen Worten, Zellen, die Ascl1 ausdrücken, werden rot. Da Ascl1 nur in RPCs9 exprimiert wird, ermöglicht diese Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-Maus die Verfolgung der MG-Umwandlung in Ascl1-exprimierende RPCs, was bedeutet, dass die Umwandlung von Zellen rot fluoreszierendes tdTomaten-Reporterprotein exprimiert. Dies ist eine irreversible Markierung, da die DNA dieser Zellen verändert ist. Folglich wird jede nachfolgende neuronale Differenzierung visualisiert, da die tdTomato-Markierung in differenzierenden Zellen verbleibt. Wenn Ascl1-exprimierende MG-abgeleitete RPCs (mit tdTomato-Label) in Neuronen differenzieren, haben diese Neuronen immer noch ihre rote Markierung. Diese Maus ermöglicht daher nicht nur die Markierung von MG-abgeleiteten RPCs für die Live-Cell-Bildgebung, sondern ermöglicht auch die Schicksalskartierung und Abstammungsverfolgung dieser MG-abgeleiteten (roten) RPCs. In jüngerer Zeit wurde der Satz von miRNAs in RPCs identifiziert und MG-Kulturen von Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reporter-Mäusen wurden verwendet, um die Wirkung dieser miRNAs auf die Reprogrammierungskapazität und -effizienz zu screenen und zu testen27. Ein Kandidat, die RPC-miRNA miR-25, wurde in der Lage befunden, kultiviertes MG in Ascl1-exprimierende (Ascl1-Tomato+) Zellen umzuprogrammieren. Diese reprogrammierten Zellen nehmen im Laufe der Zeit neuronale Merkmale an, einschließlich der neuronalen Morphologie (kleine Somata und entweder kurze oder lange Feinprozesse), der Expression neuronaler Transkripte, die über scRNA-Seq gemessen werden, sowie der Expression neuronaler Proteine, die über Immunfluoreszenzmarkierung validiert wurden27.
Hier beschreibt das Protokoll, wie MG von P12-Mäusen gezüchtet und transfiziert werden kann, angepasst an die vorherige Arbeit21,24,27. Für dieses Protokoll wurde die oben erwähnte miRNA miR-25 ausgewählt, eine miRNA, die in RPCs hoch exprimiert wird, mit niedrigen Expressionsspiegeln in MG- oder Netzhautneuronen. Um miR-25 zu überexprimieren, werden murine miR-25-Moleküle verwendet, d.h. künstliche miRNA-Moleküle. Zur Kontrolle werden Nachahmungen einer miRNA aus Caenorhabditis elegans gewählt, die in Säugetierzellen keine Funktion haben. Die Visualisierung der Umwandlung von MG in RPCs erfolgte über die RPC-Reportermaus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), eine Maus mit gemischtem Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnungen). Diese Kultur kann jedoch mit allen Mausstämmen, einschließlich Wildtyp-Stämmen, durchgeführt werden. In den letzten Jahren wurde das ursprüngliche Protokoll modifiziert, um die Dauer der Wachstumsphase und die Gesamtkulturperiode zu reduzieren und einen robusteren Gliazellenstatus zu gewährleisten und den Grad der zellulären Degeneration, die in längeren Kulturperioden auftritt, zu minimieren. Auch das reguläre Transfektionszeitfenster wurde von 3 h auf 2 Tage verlängert. Obwohl das aktuelle Protokoll MG-Kulturen als Werkzeug für Regenerationsstudien beschreibt, ist die Methode nicht nur zum Testen von Reprogrammierungsfaktoren nützlich, sondern kann auch für andere Anwendungen angepasst werden, einschließlich Studien über MG-Migrations- oder Proliferationsverhalten, Verletzungs- / Zellschadensparadigmen und / oder die Identifizierung zugrunde liegender Mechanismen und Signalwege.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie MG aus dissoziierten Mausnetzhäuten für Reprogrammierungsstudien mit miRNAs gezüchtet werden kann. Wie in einer Vielzahl früherer Studien gezeigt und bestätigt wurde, ist die überwiegende Mehrheit (80% -90%) der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG20,23,24. Diese Methode ist eine sehr robuste und zuverlässige Technik und die Ergebnisse können leicht reproduziert werden, wenn das Protok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Ann Beaton und allen Labormitgliedern für ihren Beitrag zum Manuskript. Besonderer Dank geht an Dr. Tom Reh, Dr. Julia Pollak und Dr. Russ Taylor für die Einführung von MG-Primärkulturen als Screening-Tool für S.G.W. während der Postdoc-Ausbildung an der University of Washington in Seattle. Die Studie wurde durch den Empire Innovation Program (EIP) Grant an S.G.W. und Start-up-Mittel von SUNY Optometry an S.G.W. sowie den R01EY032532 Award des National Eye Institute (NEI) an S.G.W. finanziert.
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. 발생학. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. 발생학. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
