माइक्रोआरएनए उपचार के बाद मुरिन मुलर ग्लिया की पुनर्जनन क्षमता का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक सेल संस्कृतियां
Summary
माउस रेटिना से प्राप्त मुलर ग्लिया प्राथमिक संस्कृतियां माइक्रोआरएनए उपचार के बाद रेटिना पूर्वज कोशिकाओं में ग्लियाल रूपांतरण का अध्ययन करने के लिए एक बहुत मजबूत और विश्वसनीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। विवो दृष्टिकोण में उनके बाद के आवेदन से पहले एकल अणुओं या संयोजनों का परीक्षण किया जा सकता है।
Abstract
मुलर ग्लिया (एमजी) तंत्रिका रेटिना में प्रमुख ग्लिया हैं और रेटिना न्यूरॉन्स के लिए पुनर्योजी स्रोत के रूप में कार्य कर सकते हैं। मछली जैसे निचले कशेरुकियों में, एमजी-चालित उत्थान स्वाभाविक रूप से होता है; स्तनधारियों में, हालांकि, कुछ कारकों या आनुवंशिक / एपिजेनेटिक हेरफेर के साथ उत्तेजना की आवश्यकता होती है। चूंकि एमजी में रेटिना सेल आबादी का केवल 5% शामिल है, इसलिए मॉडल सिस्टम की आवश्यकता है जो विशेष रूप से इस सेल आबादी के अध्ययन की अनुमति देते हैं। इन मॉडल प्रणालियों में से एक प्राथमिक एमजी संस्कृतियां हैं जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और इसका उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें अणु / कारक स्क्रीनिंग और पहचान, यौगिकों या कारकों का परीक्षण, सेल निगरानी और / या कार्यात्मक परीक्षण शामिल हैं। इस मॉडल का उपयोग कृत्रिम एमआईआरएनए या उनके अवरोधकों के अभिकर्मक के माध्यम से माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) के पूरक या निषेध के बाद रेटिना न्यूरॉन्स में परिवर्तित करने के लिए म्यूरिन एमजी की क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग और सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) के संयोजन में एमजी-विशिष्ट रिपोर्टर चूहों के उपयोग ने पुष्टि की कि इन संस्कृतियों में पाई जाने वाली 80% -90% कोशिकाएं एमजी हैं। इस मॉडल का उपयोग करके, यह पता चला कि एमआईआरएनए एमजी को रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी) में पुन: प्रोग्राम कर सकते हैं, जो बाद में न्यूरोनल जैसी कोशिकाओं में अंतर करते हैं। इस तकनीक के फायदे यह हैं कि एमआईआरएनए उम्मीदवारों को विवो अनुप्रयोगों में उनके उपयोग से पहले उनकी दक्षता और परिणाम के लिए परीक्षण किया जा सकता है।
Introduction
मुलर ग्लिया (एमजी) तंत्रिका रेटिना में प्रमुख ग्लिया हैं। उनके पास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य हिस्सों में अन्य ग्लिया की तुलना में समान कार्य हैं जैसे कि पानी और आयन होमियोस्टेसिस को बनाए रखना, न्यूरॉन्स को पौष्टिक करना और ऊतक की रक्षा करना। एमजी की एक और आकर्षक विशेषता है: हालांकि वे परिपक्व ग्लिया हैं, फिर भी वे देर से विकास 1,2 के दौरान रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी) में व्यक्त कई जीन व्यक्त करते हैं। इस समानता को रेटिना क्षति 3,4 के बाद मछली रेटिना में स्वाभाविक रूप से होने वाली एमजी-आधारित न्यूरोनल पुनर्जननका कारण माना जाता है। इस प्रक्रिया के दौरान, एमजी सेल चक्र में फिर से प्रवेश करता है और आरपीसी में अंतर करता है जो तब सभी छह प्रकार के रेटिना न्यूरॉन्स में अंतर करता है। यद्यपि यह घटना मछली में स्वाभाविक रूप से होती है, स्तनधारी एमजी न्यूरॉन्स 5,6 में परिवर्तित नहीं होता है। हालाँकि, उन्हें फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है। न्यूरॉन्स में एमजी को पुन: प्रोग्राम करने के लिए विभिन्न कारकों को दिखाया गया है; इन कारकों में मूल हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (बीएचएलएच) प्रतिलेखन कारक अचेट-स्कूट होमोलॉग 1 (एएससीएल 1) है जो मछली पुनर्जनन 7,8 में शामिल है। चूहों में, एएससीएल 1 केवल रेटिनोजेनेसिस के दौरान आरपीसी में व्यक्त किया जाता है लेकिन परिपक्व एमजी या रेटिना न्यूरॉन्स9 में अनुपस्थित है।
विवो में सीधे कोशिकाओं को रीप्रोग्राम करना न केवल पद्धतिगत रूप से चुनौतीपूर्ण है, बल्कि एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन की भी आवश्यकता है। अनुमोदन प्राप्त करने के लिए, उपयोग किए गए या परिवर्तित किए गए कारकों, सांद्रता, ऑफ-टारगेट प्रभाव, अंतर्निहित तंत्र, विषाक्तता और दक्षता के बारे में प्रारंभिक डेटा की आवश्यकता होती है। सेल संस्कृति प्रणाली विवो मॉडल में उपयोग से पहले इन मानदंडों के लिए परीक्षण की अनुमति देती है। इसके अलावा, चूंकि एमजी में पूरे रेटिना सेल आबादी10 का केवल 5% शामिल है, एमजी संस्कृतियां उनके कार्य11 के अध्ययन के साथ-साथ उनके व्यवहार की अनुमति देती हैं, जिसमें माइग्रेशन12,13, प्रसार14, चोट / क्षति 15,16 के लिए तनाव प्रतिक्रिया, माइक्रोग्लिया17 या रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) 18 जैसे अन्य सेल प्रकारों के साथ उनकी बातचीत शामिल है, या उनकी न्यूरोजेनिक क्षमता 19,20,21। कई शोधकर्ता अपने अध्ययन के लिए अमर सेल लाइनों का उपयोग करते हैं क्योंकि उनके पास असीमित प्रसार क्षमता होती है और आसानी से बनाए रखा जा सकता है और ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है। प्राथमिक कोशिकाएं, हालांकि, अमर कोशिकाओं की तुलना में जैविक रूप से प्रासंगिक परखों के लिए बेहतर हैं क्योंकि उनके पास सच्ची कोशिका विशेषताएं (जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति) हैं और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि वे विकास में एक निश्चित चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और इसलिए “उम्र” है। एक जानवर की उम्र (और परिणामस्वरूप एक जानवर से प्राप्त कोशिकाओं की) सेलुलर रिप्रोग्रामिंग में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि सेल प्लास्टिसिटी विकास के प्रगतिशील चरण के साथ कम हो जाती है22.
यह प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए वर्तमान इन विट्रो विधि के रूप में एमआईआरएनए के साथ प्राथमिक एमजी को कैसे पुन: प्रोग्राम किया जाए। यह एमजी प्राथमिक संस्कृति मॉडल 2012 में पी 53 नॉक-आउट चूहों (टीआरपी 53-/- चूहों) 23 में एमजी की सेल प्रसार विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया था। यह दिखाया गया था कि सुसंस्कृत एमजी अपनी ग्लियाल विशेषताओं को बनाए रखता है (यानी, इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के माध्यम से मूल्यांकन किए गए एस 100β, पैक्स 6 और सोक्स 2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति), और वे विवो एमजी (एफएसीएस-शुद्ध एमजी के माइक्रोएरे) 23 में समान हैं। इसके तुरंत बाद, ग्लियाल एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति को वायरल वैक्टर20 का उपयोग करके एक अलग दृष्टिकोण में मान्य और पुष्टि की गई थी। कुछ साल बाद, यह पुष्टि की गई कि इन संस्कृतियों में पाई जाने वाली अधिकांश कोशिकाएं एमजी-विशिष्ट आरएलबीपी 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / इसके अलावा, एफएसीएस-शुद्ध एमजी और सुसंस्कृत प्राथमिक एमजी दोनों में एमआईआरएनए के सेट की मात्रा का ठहराव से पता चला है कि विकास चरण के दौरान सुसंस्कृत एमजी में एमजी एमआईआरएनए (एमजीलियोमिर) का स्तर बहुत भिन्न नहीं होता है। लम्बी संस्कृति अवधि, हालांकि, एमआईआरएनए के स्तर में परिवर्तन का कारण बनती है और परिणामस्वरूप एमआरएनए स्तर और प्रोटीन अभिव्यक्ति में होती है क्योंकि एमआईआरएनए ट्रांसलेशनल नियामकहैं 25.
2013 में, इस एमजी संस्कृति मॉडल का उपयोग रेटिना न्यूरॉन्स20 में एमजी को पुन: प्रोग्राम करने की उनकी क्षमता के संबंध में विभिन्न प्रतिलेखन कारकों का परीक्षण करने के लिए किया गया था। एएससीएल 1 को एक बहुत मजबूत और विश्वसनीय रिप्रोग्रामिंग कारक पाया गया। वायरल वैक्टर के माध्यम से एएससीएल 1 की ओवरएक्सप्रेशन ने रूपात्मक परिवर्तन, न्यूरोनल मार्करों की अभिव्यक्ति और न्यूरोनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अधिग्रहण किया। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इन पहले इन विट्रो प्रयोगों से प्राप्त अंतर्दृष्टि और परिणामों को सफलतापूर्वक विवो अनुप्रयोगों22,26 में स्थानांतरित कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि प्राथमिक एमजी संस्कृतियां प्रारंभिक कारक स्क्रीनिंग और विवो कार्यान्वयन से पहले ग्लियाल सुविधाओं के मूल्यांकन के लिए एक ठोस और विश्वसनीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं।
कुछ साल पहले, यह दिखाया गया था कि मस्तिष्क समृद्ध एमआईआरएनए एमआईआर -124, जो रेटिना न्यूरॉन्स में भी अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, सुसंस्कृत एमजी21 में एएससीएल 1 अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। जीवित कोशिकाओं में एएससीएल 1 अभिव्यक्ति को एएससीएल 1 रिपोर्टर माउस (एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एक रिपोर्टर माउस एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस है जिसके डीएनए में एक रिपोर्टर जीन डाला जाता है। यह रिपोर्टर जीन एक रिपोर्टर प्रोटीन के लिए एन्कोड करता है, जो इस अध्ययन में है टीडीटोमैटो, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन। यह रिपोर्टर प्रोटीन ब्याज के एक जीन की अभिव्यक्ति की रिपोर्ट करता है, इस मामले में, एएससीएल 1। दूसरे शब्दों में, एएससीएल 1 व्यक्त करने वाली कोशिकाएं लाल हो जाएंगी। चूंकि एएससीएल 1 केवल आरपीसी9 में व्यक्त किया जाता है, इसलिए यह एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल माउस एमजी रूपांतरण को एएससीएल 1 व्यक्त करने वाले आरपीसी में ट्रैकिंग की अनुमति देता है, जिसका अर्थ है कि परिवर्तित कोशिकाएं लाल फ्लोरोसेंट टीडीटोमैटो रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करेंगी। यह अपरिवर्तनीय लेबलिंग है क्योंकि इन कोशिकाओं के डीएनए को बदल दिया जाता है। नतीजतन, किसी भी बाद के न्यूरोनल भेदभाव की कल्पना की जाएगी क्योंकि टीडीटोमैटो लेबल विभेदक कोशिकाओं में रहता है। यदि एमजी-व्युत्पन्न आरपीसी (टीडीटोमैटो लेबल के साथ) व्यक्त करने वाले एएससीएल 1 न्यूरॉन्स में अंतर करते हैं, तो इन न्यूरॉन्स में अभी भी उनका लाल लेबल होगा। इसलिए, यह माउस न केवल लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एमजी-व्युत्पन्न आरपीसी की लेबलिंग की अनुमति देता है, बल्कि इन एमजी-व्युत्पन्न (लाल) आरपीसी के भाग्य मानचित्रण और वंश अनुरेखण की भी अनुमति देता है। हाल ही में, आरपीसी में एमआईआरएनए के सेट की पहचान की गई थी और एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल आरपीसी-रिपोर्टर चूहों की एमजी संस्कृतियों का उपयोग रीप्रोग्रामिंग क्षमता और दक्षता27 पर इन एमआईआरएनए के प्रभाव को स्क्रीन और परीक्षण करने के लिए किया गया था। एक उम्मीदवार, आरपीसी-एमआईआरएनए एमआईआर -25, सुसंस्कृत एमजी को एएससीएल 1 एक्सप्रेसिंग (एएससीएल 1-टमाटर +) कोशिकाओं में रीप्रोग्रामकरने में सक्षम पाया गया था। ये पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाएं समय के साथ न्यूरोनल विशेषताओं को अपनाती हैं, जिसमें न्यूरोनल आकृति विज्ञान (छोटे सोमाटा और या तो छोटी या लंबी ठीक प्रक्रियाएं), एससीआरएनए-सेक के माध्यम से मापा गया न्यूरोनल टेप की अभिव्यक्ति, साथ ही इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग27 के माध्यम से मान्य न्यूरोनल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल है।
यहां, प्रोटोकॉल विवरण कैसे बढ़ने के लिए और पिछले काम 21,24,27 से अनुकूलित पी12 चूहों से एमजी ट्रांसफेक्ट करने के लिए। इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया उपरोक्त एमआईआरएनए एमआईआर -25 है, जो एमजी या रेटिना न्यूरॉन्स में कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ आरपीसी में अत्यधिक व्यक्त किया गया एक एमआईआरएनए है। एमआईआर -25 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए, म्यूरिन एमआईआर -25 नकल, यानी, कृत्रिम एमआईआरएनए अणुओं का उपयोग किया जाता है। एक नियंत्रण के रूप में, कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस से एमआईआरएनए की नकल को चुना जाता है, जिसका स्तनधारी कोशिकाओं में कोई कार्य नहीं होता है। आरपीसी में एमजी के रूपांतरण का दृश्य आरपीसी रिपोर्टर माउस (एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल) के माध्यम से पूरा किया गया था, मिश्रित पृष्ठभूमि (सी 57 बीएल / 6, एस 12 9, और आईसीआर उपभेदों) के साथ एक माउस। हालांकि, यह संस्कृति जंगली प्रकार के उपभेदों सहित सभी माउस उपभेदों के साथ की जा सकती है। पिछले कुछ वर्षों में, मूल प्रोटोकॉल को विकास चरण अवधि और समग्र संस्कृति अवधि को कम करने और अधिक मजबूत ग्लिया सेल की स्थिति सुनिश्चित करने और सेलुलर अध: पतन की डिग्री को कम करने के लिए संशोधित किया गया है, जो लंबे समय तक संस्कृति अवधि में होता है। नियमित अभिकर्मक समय खिड़की को भी 3 घंटे से 2 दिनों तक बढ़ाया गया था। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल एमजी संस्कृतियों को पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक उपकरण के रूप में वर्णित करता है, विधि न केवल रीप्रोग्रामिंग कारकों के परीक्षण के लिए उपयोगी है, बल्कि अन्य अनुप्रयोगों के लिए भी अनुकूलित की जा सकती है, जिसमें एमजी प्रवासी या प्रसार व्यवहार, चोट /
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एमआईआरएनए का उपयोग करके रीप्रोग्रामिंग अध्ययन के लिए अलग-अलग माउस रेटिना से एमजी कैसे विकसित किया जाए। जैसा कि पिछले अध्ययनों की एक किस्म में दिखाया गया है और पुष्टि की ग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि पर अपने इनपुट के लिए डॉ एन बीटन और सभी प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। सिएटल में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में पोस्टडॉक्टोरल प्रशिक्षण के दौरान एसजीडब्ल्यू को स्क्रीनिंग टूल के रूप में एमजी प्राथमिक संस्कृतियों को पेश करने के लिए डॉ टॉम रेह, जूलिया पोलक और रस टेलर को विशेष धन्यवाद। अध्ययन को एसजीडब्ल्यू को एम्पायर इनोवेशन प्रोग्राम (ईआईपी) अनुदान और सनी ऑप्टोमेट्री से एसजीडब्ल्यू तक स्टार्ट-अप फंड के साथ-साथ नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) से एसजीडब्ल्यू तक आर 01 ईवाई032532 पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
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