Müller glia primære kulturer hentet fra musehinnen representerer et meget robust og pålitelig verktøy for å studere glialkonvertering til retinale stamceller etter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinasjoner kan testes før deres påfølgende anvendelse av in vivo-tilnærminger .
Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina og kan fungere som en regenerativ kilde for retinale nevroner. Hos lavere virveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturlig; hos pattedyr er det imidlertid nødvendig med stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulasjon. Siden MG bare utgjør 5% av retinalcellepopulasjonen, er det behov for modellsystemer som utelukkende tillater studier av denne cellepopulasjonen. Et av disse modellsystemene er primære MG-kulturer som er reproduserbare og kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert screening og identifisering av molekyler / faktorer, testing av forbindelser eller faktorer, celleovervåking og / eller funksjonstester. Denne modellen brukes til å studere potensialet til murine MG for å konvertere til retinale nevroner etter tilskudd eller inhibering av mikroRNA (miRNA) via transfeksjon av kunstige miRNA eller deres hemmere. Bruken av MG-spesifikke reportermus i kombinasjon med immunfluorescerende merking og enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekreftet at 80% -90% av cellene som finnes i disse kulturene er MG. Ved hjelp av denne modellen ble det oppdaget at miRNA kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC), som senere skiller seg ut i nevronlignende celler. Fordelene med denne teknikken er at miRNA-kandidater kan testes for effektivitet og utfall før de brukes i in vivo-applikasjoner .
Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina. De har lignende funksjoner sammenlignet med andre glia i andre deler av sentralnervesystemet, for eksempel å opprettholde vann- og ionhomeostase, nærende nevroner og beskytte vevet. MG har en annen fascinerende funksjon: selv om de er modne glia, uttrykker de fortsatt mange gener uttrykt i retinale stamceller (RPC) under sen utvikling 1,2. Denne likheten antas å være årsaken til den naturlig forekommende MG-baserte nevronregenereringen i fiskehinnen etter retinal skade 3,4. I løpet av denne prosessen går MG inn i cellesyklusen og de-differensierer til RPC-er som deretter differensierer i alle seks typer retinale nevroner. Selv om dette fenomenet forekommer naturlig i fisk, konverterer ikke pattedyr MG til nevroner 5,6. De kan imidlertid omprogrammeres. En rekke faktorer har vist seg å omprogrammere MG til RPC/nevroner; blant disse faktorene er den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktoren achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som er involvert i fiskregenerering 7,8. Hos mus uttrykkes Ascl1 bare i RPC under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale nevroner9.
Omprogrammering av celler direkte in vivo er ikke bare metodisk utfordrende, men krever også godkjenning fra en institusjonell dyrepleie- og brukskomité. For å motta godkjenning kreves foreløpige data om faktoren(e) som er brukt eller endret, konsentrasjoner, off-target effekter, underliggende mekanismer, toksisitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillater testing for disse kriteriene før bruk i in vivo-modeller. Videre, siden MG bare utgjør omtrent 5% av hele retinalcellepopulasjonen10, tillater MG-kulturer studier av deres funksjon11 også deres oppførsel, inkludert migrasjon12,13, spredning14, stressreaksjon på skade / skade15,16, deres interaksjon med andre celletyper som microglia17 eller retinale ganglionceller (RGCs)18, eller deres nevrogene potensial 19,20,21. Mange forskere bruker udødelige cellelinjer for sine studier siden de har et ubegrenset proliferativt potensial og lett kan vedlikeholdes og transfectederes. Primære celler er imidlertid å foretrekke for biologisk relevante analyser enn immortaliserte celler siden de har sanne celleegenskaper (gen- og proteinuttrykk), og enda viktigere, de representerer et bestemt utviklingsstadium og derfor har en “alder”. Alderen til et dyr (og følgelig av cellene hentet fra et dyr) er en spesielt avgjørende faktor i cellulær omprogrammering siden celleplastisiteten reduseres med utviklet utviklingsstadium22.
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA som en nåværende in vitro-metode for å studere regenerering. Denne MG primære kulturmodellen ble etablert i 2012 for å evaluere celleproliferasjonsegenskaper for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)23. Det ble vist at kultivert MG opprettholder sine glialegenskaper (dvs. ekspresjon av S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evaluert via immunfluorescerende merking), og at de ligner in vivo MG (mikromatrise av FACS-renset MG)23. Kort tid etter ble glial mRNA og proteinuttrykk validert og bekreftet i en annen tilnærming ved bruk av virale vektorer20. Noen år senere ble det bekreftet at de aller fleste cellene som finnes i disse kulturene er MG ved hjelp av MG-spesifikke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mus24. Videre viste kvantifisering av settet av miRNA i både FACS-renset MG og kultivert primær MG at nivåene av MG miRNA (mGLiomiRs) ikke varierer mye i kultivert MG i vekstfasen. Langstrakte kulturperioder forårsaker imidlertid endringer i miRNA-nivåer og følgelig i mRNA-nivåer og proteinuttrykk siden miRNA er translasjonsregulatorer25.
I 2013 ble denne MG-kulturmodellen brukt til å teste en rekke transkripsjonsfaktorer med hensyn til deres evne til å omprogrammere MG til retinale nevroner20. Ascl1 ble funnet å være en svært robust og pålitelig omprogrammeringsfaktor. Overekspresjon av Ascl1 via virale vektorer induserte morfologiske endringer, ekspresjon av nevronmarkører og oppkjøp av nevronale elektrofysiologiske egenskaper. Enda viktigere, innsikten og resultatene fra disse første in vitro-eksperimentene ble vellykket overført til in vivo-applikasjoner 22,26 som viser at primære MG-kulturer representerer et solid og pålitelig verktøy for innledende faktorscreening og evaluering av glialfunksjoner før in vivo implementering.
For noen år siden ble det vist at hjerneberiket miRNA miR-124, som også er sterkt uttrykt i retinale nevroner, kan indusere Ascl1-uttrykk i dyrket MG21. Ascl1-uttrykk i levende celler ble visualisert via en Ascl1 reportermus (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). En reportermus er en genmodifisert mus som har et reportergen satt inn i sitt DNA. Dette reportergenet koder for et reporterprotein, som er i denne studien tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Dette reporterproteinet rapporterer uttrykket av et gen av interesse, i dette tilfellet Ascl1. Med andre ord, celler som uttrykker Ascl1 vil bli røde. Siden Ascl1 bare uttrykkes i RPC9, tillater denne Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-musen sporing av MG-konvertering til Ascl1-uttrykk for RPC-er, noe som betyr at konvertering av celler vil uttrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel merking siden DNA fra disse cellene er endret. Følgelig vil enhver etterfølgende nevrondifferensiering bli visualisert fordi tdTomato-etiketten forblir i differensierende celler. Hvis Ascl1 som uttrykker MG-avledede RPC-er (med tdTomato-etikett) skiller seg ut i nevroner, vil disse nevronene fortsatt ha sin røde etikett. Denne musen tillater derfor ikke bare merking av MG-avledede RPC-er for levende celleavbildning, men tillater også skjebnekartlegging og avstamningssporing av disse MG-avledede (røde) RPC-ene. Mer nylig ble settet med miRNA i RPC-er identifisert, og MG-kulturer av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermus ble brukt til å skjerme og teste effekten av disse miRNA-ene på omprogrammeringskapasitet og effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, ble funnet i stand til å omprogrammere kultivert MG til Ascl1-uttrykkende (Ascl1-Tomato +) celler. Disse omprogrammerte cellene adopterer nevronale egenskaper over tid, inkludert nevronmorfologi (liten somata og enten korte eller lange fine prosesser), uttrykk for nevronale transkripsjoner målt via scRNA-Seq, samt ekspresjon av nevronproteiner validert via immunfluorescerende merking27.
Her beskriver protokollen hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra forrige arbeid 21,24,27. Valgt for denne protokollen er den nevnte miRNA miR-25, et miRNA sterkt uttrykt i RPC, med lave ekspresjonsnivåer i MG eller retinale nevroner. For å overuttrykke miR-25, brukes murine miR-25 etterligner, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som en kontroll velges etterligninger av et miRNA fra Caenorhabditis elegans, som ikke har noen funksjon i pattedyrceller. Visualisering av konverteringen av MG til RPC-er ble oppnådd via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandet bakgrunn (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne kulturen kan imidlertid utføres med alle musestammer, inkludert villtypestammer. I løpet av de siste årene har den opprinnelige protokollen blitt modifisert for å redusere vekstfasevarigheten og den generelle kulturperioden og sikre en mer robust gliacellestatus og minimere graden av cellulær degenerasjon, som oppstår i lengre kulturperioder. Det vanlige transfeksjonstidsvinduet ble også utvidet fra 3 timer til 2 dager. Som nevnt tidligere, selv om den nåværende protokollen beskriver MG-kulturer som et verktøy for regenereringsstudier, er metoden ikke bare nyttig for å teste omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses for andre applikasjoner, inkludert studier om MG-migrerende eller proliferativ oppførsel, skade / celleskaderelaterte paradigmer og / eller identifisering av underliggende mekanismer og veier.
Denne protokollen beskriver hvordan man dyrker MG fra dissosierte musehinner for omprogrammering av studier ved bruk av miRNA. Som vist og bekreftet i en rekke tidligere studier, er det store flertallet (80% -90%) av cellene som finnes i disse kulturer MG 20,23,24. Denne metoden er en veldig robust og pålitelig teknikk, og resultatene kan enkelt reproduseres hvis protokollen følges riktig21,27</sup…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Ann Beaton og alle laboratoriemedlemmer for deres innspill til manuskriptet. Spesiell takk går til Dr. Tom Reh, Julia Pollak og Russ Taylor for å introdusere MG primære kulturer som et screeningsverktøy til S.G.W. under postdoktorutdanning ved University of Washington i Seattle. Studien ble finansiert av Empire Innovation Program (EIP) Grant til S.G.W. og oppstartsmidler fra SUNY Optometry til S.G.W., samt R01EY032532-prisen fra National Eye Institute (NEI) til S.G.W.
Animals | |||
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
Reagents | |||
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
plasticware/supplies | |||
0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
equipment | |||
1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |