JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Nitroreductase/metronidazolmedieret ablation og en MATLAB-platform (RpEGEN) til undersøgelse af regenerering af zebrafiskens retinale pigmentepitel

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver metoden til genetisk at ablate retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af en transgen zebrafiskmodel. Tilpasning af protokollen til at inkorporere signalvejsmodulering ved hjælp af farmakologiske forbindelser er udførligt detaljeret. En MATLAB-platform til kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering blev udviklet og præsenteres og diskuteres.

Abstract

Retinalpigmentepitelet (RPE) befinder sig på bagsiden af øjet og udfører funktioner, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af tilstødende retinale og vaskulære væv. På nuværende tidspunkt har den begrænsede reparative kapacitet hos pattedyrs RPE, som er begrænset til små skader, hindret fremskridt med hensyn til at forstå in vivo RPE regenerative processer. Her tilvejebringes en detaljeret metode til at lette undersøgelsen af in vivo RPE-reparation ved hjælp af zebrafisken, en hvirveldyrmodel, der er i stand til robust vævsregenerering. Denne protokol beskriver et transgent nitroreduktase/metronidazol (NTR/MTZ)-medieret skadesparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablation af de centrale to tredjedele af RPE efter 24 timers behandling med MTZ med efterfølgende vævsgenopretning. Der fokuseres på RPE-ablationer i larvezebrafisk, og metoder til test af farmakologiske forbindelsers virkninger på RPE-regenerering er også skitseret. Generering og validering af RpEGEN, et MATLAB-script oprettet for at automatisere kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering, diskuteres også. Ud over aktive RPE-reparationsmekanismer kan denne protokol udvides til undersøgelser af RPE-degeneration og skadesresponser samt virkningerne af RPE-skader på tilstødende retinale og vaskulære væv, blandt andre cellulære og molekylære processer. Dette zebrafiskesystem har et betydeligt løfte om at identificere gener, netværk og processer, der driver RPE-regenerering og RPE-sygdomsrelaterede mekanismer, med det langsigtede mål at anvende denne viden på pattedyrssystemer og i sidste ende mod terapeutisk udvikling.

Introduction

Metoden beskrevet heri beskriver en protokol til genetisk ablat retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af larvezebrafisk. RPE strækker sig over bagsiden af øjet og befinder sig mellem de stratificerede lag af den neurale nethinde og det lag af vaskulatur, der udgør choroid. Trofisk støtte, absorption af fototoksisk lys og vedligeholdelse af visuelle cyklusproteiner er kun nogle af de kritiske funktioner, RPE udfører, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af disse tilstødende væv1. Skader på pattedyrs RPE kan repareres, når læsionerne er små2; Skader, der er lidt af større skader eller progressiv degenerativ sygdom, er imidlertid irreversible. Hos mennesker fører RPE-degenerative sygdomme (f.eks. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og Stargardt-sygdom) til permanent synstab og, med få behandlingsmuligheder til rådighed, nedsat patientkvalitet. Den begrænsede evne for pattedyrs RPE til selvreparation har skabt et vidensgab inden for RPE-regenerative processer. I betragtning af zebrafiskens robuste regenerative kapacitet på tværs af mange forskellige vævstyper blev denne protokol udviklet til at etablere et in vivo-hvirveldyrsystem for at lette undersøgelser af iboende regenerering af RPE og afdække mekanismer, der driver dette svar. Ved hjælp af ablationsparadigmet, der er skitseret her, er den kanoniske Wnt-signalvej3, mTOR-vejen4 og immunrelaterede responser5 blevet identificeret som kritiske mediatorer for RPE-regenerering, sandsynligvis med overlappende funktioner.

I dette genetiske ablationsparadigme udtrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafisk det bakterieafledte nitroreduktase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen med eGFP under kontrol af RPE-forstærkerelementet, rpe65a7. Ablation opnås ved at tilsætte prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvand, der huser zebrafisk. Intracellulær aktivering af MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-tværbinding og apoptose i NTR/nfsB-ekspressionerende celler 8,9. Denne teknologi er blevet anvendt i vid udstrækning i zebrafisk til at ablatere celler i nethinden 10,11,12,13 og andre væv 8. Tilsammen muliggør disse elementer målrettet ekspression (rpe65a) af en inducerbar celleablationsmetode (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) til visualisering.

Der findes også andre interessante in vivo-modeller, der kan bruges til at studere RPE14’s regenerative potentiale. Disse er brede og omfatter RPE-til-retina transdifferentiering post-retinektomi hos padder, hvor RPE-celler tabt til retinal genvækst erstattes15,16; RPE-restaurering efter skade i “super healing” MRL / MpJ-musen17; og eksogen stimulering af RPE-spredning i en rottemodel af spontan RPE og retinal degeneration18, blandt andre. Der er også udviklet in vitro-modeller, f.eks. voksne humane RPE-stamceller (RPESC’er)19. Disse modeller er alle værdifulde værktøjer, der arbejder for at afdække de cellulære processer relateret til RPE-regenerering (f.eks. Spredning, differentiering osv.); zebrafisken er dog unik i sin evne til iboende RPE-reparation efter ablation.

Mens metoden her er skrevet for at fokusere på at forstå de mekanismer, der driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -linjen og denne genetiske ablationsprotokol bruges til at studere andre cellulære processer såsom RPE-apoptose, RPE-degeneration og effekten af RPE-skade på tilstødende retinale og vaskulære væv. Ablationsprotokollen kan også ændres til at omfatte farmakologisk manipulation, hvilket er en bekvem foreløbig strategi til at screene signalveje af interesse. For eksempel har blokering af den kanoniske Wnt-vej ved hjælp af Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist sig at forringe RPE-regenerering3. Dette blev gentaget her for at guide brugerne gennem et farmakologisk manipulationseksperiment og tjene som proof-of-concept for at validere et MATLAB-script (RpEGEN), der blev oprettet for at kvantificere RPE-regenerering baseret på genopretning af pigmentering. Ligesom den transgene linje og ablationsprotokollen er RpEGEN-scripts tilpasningsdygtige og kan bruges til at kvantificere andre markører / cellulære processer inden for RPE.

Protocol

Alle metoder, der er skitseret heri, er i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh. 1. Forberedelse forud for indsamling af zebrafiskembryoner Indstil embryoinkubator til 28,5 ° C. Der fremstilles en 25x stamopløsning af melanogenesehæmmeren, N-phenylthiourea (PTU)21,22. Denne stamopløsning skaleres ud fra en almindelig opskri…

Representative Results

Hæmning af den kanoniske Wnt-signalvej er kendt for signifikant at forringe zebrafisk RPE-regenerering ved hjælp af det genetiske ablationsparadigme (rpe65a: nfsB-eGFP) og farmakologisk manipulationsmetode (IWR-1) beskrevet i protokol3. Dette eksperiment blev gentaget her for at validere en automatiseret metode til kvantificering af zebrafisk RPE-regenerering baseret på pigmentering. Resultaterne opsummeret nedenfor omfattede alle trin i protokollen, fra befrugtningsdagen (0 dpf) til k…

Discussion

Denne protokol beskriver metoden til genetisk ablat rpE og undersøgelsesmekanismer for degeneration og regenerering i larvelagrede zebrafisk. Denne protokol er også blevet udført med succes i voksne zebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, hvorfor larver er i fokus her. Kritiske aspekter af denne del af protokollen (trin 1-4) omfatter: 1) tilføjelse af 1,5x PTU til embryoner før begyndelsen af melanogenese, 2) deforkortende PTU-behandlede embryoner på 2-3 dpf, 3) omhyggelig scr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbejdet beskrevet heri blev støttet af National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institut for Oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti Chair i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Yderligere støtte blev modtaget fra Wiegand Fellowship in Ophthalmology (til L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere vil også gerne takke Amanda Platt for teknisk bistand og Dr. Hugh Hammer og akvatikpersonalet for fremragende dyreplejestøtte.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. 발생학. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. 발생학. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub – ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Keywords: ZebrafishRetinal Pigment EpitheliumRPERegenerationNitroreductaseMetronidazoleMATLABRpEGENAblationTransgenicEGFPPTUPharmacological Treatment
check_url/kr/63658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image