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생물학

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l’epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L’adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Abstract

L’epitelio pigmentato retinico (RPE) risiede nella parte posteriore dell’occhio e svolge funzioni essenziali per mantenere la salute e l’integrità dei tessuti retinici e vascolari adiacenti. Allo stato attuale, la limitata capacità riparativa dell’RPE nei mammiferi, che è limitata a piccole lesioni, ha ostacolato il progresso verso la comprensione dei processi rigenerativi RPE in vivo . Qui, viene fornita una metodologia dettagliata per facilitare lo studio della riparazione RPE in vivo utilizzando il pesce zebra, un modello di vertebrato in grado di una robusta rigenerazione dei tessuti. Questo protocollo descrive un paradigma di lesione transgenico mediato da nitroreduttasi/metronidazolo (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), che si traduce in ablazione dei due terzi centrali dell’RPE dopo 24 ore di trattamento con MTZ, con successivo recupero tissutale. L’attenzione è posta sulle ablazioni RPE nel pesce zebra larvale e sono anche delineati i metodi per testare gli effetti dei composti farmacologici sulla rigenerazione RPE. Viene inoltre discussa la generazione e la convalida di RpEGEN, uno script MATLAB creato per automatizzare la quantificazione della rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione. Oltre ai meccanismi attivi di riparazione RPE, questo protocollo può essere esteso agli studi sulla degenerazione RPE e sulle risposte alle lesioni, nonché sugli effetti del danno RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti, tra gli altri processi cellulari e molecolari. Questo sistema di zebrafish è promettente nell’identificazione di geni, reti e processi che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE, con l’obiettivo a lungo termine di applicare queste conoscenze ai sistemi dei mammiferi e, in definitiva, allo sviluppo terapeutico.

Introduction

La metodologia qui descritta descrive un protocollo per ablare geneticamente l’epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando il pesce zebra larvale. L’RPE si estende sulla parte posteriore dell’occhio e risiede tra gli strati stratificati della retina neurale e lo strato di vascolarizzazione che costituisce la coroide. Il supporto trofico, l’assorbimento della luce fototossica e il mantenimento delle proteine del ciclo visivo sono solo alcune delle funzioni critiche che l’RPE svolge che sono essenziali per sostenere la salute e l’integrità di questi tessuti adiacenti1. Il danno all’RPE dei mammiferi è riparabile quando le lesioni sono piccole2; tuttavia, i danni subiti da lesioni più grandi o malattie degenerative progressive sono irreversibili. Nell’uomo, le malattie degenerative RPE (ad esempio, la degenerazione maculare legata all’età (AMD) e la malattia di Stargardt) portano alla perdita permanente della vista e, con poche opzioni di trattamento disponibili, alla diminuzione della qualità della vita del paziente. La limitata capacità dell’RPE dei mammiferi di auto-ripararsi ha creato una lacuna di conoscenza nel campo dei processi rigenerativi RPE. Data la robusta capacità rigenerativa del pesce zebra in molti tipi di tessuto diversi, questo protocollo è stato sviluppato per stabilire un sistema di vertebrati in vivo per facilitare gli studi sull’RPE intrinsecamente rigenerante e scoprire i meccanismi che guidano tale risposta. Utilizzando il paradigma di ablazione qui delineato, la via di segnalazione Wnt canonica3, la via mTOR4 e le risposte immuno-correlate5 sono state identificate come mediatori critici della rigenerazione RPE, probabilmente con funzioni sovrapposte.

In questo paradigma di ablazione genetica, il pesce zebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 esprime il gene6 della nitroreductasi di derivazione batterica (NTR/nfsB) fuso a eGFP sotto il controllo dell’elemento potenziatore RPE, rpe65a7. L’ablazione si ottiene aggiungendo il profarmaco, il metronidazolo (MTZ), al sistema idrico che ospita il pesce zebra. L’attivazione intracellulare di MTZ da parte della nitroreduttasi provoca reticolazione del DNA e apoptosi nelle cellule che esprimono NTR/nfsB 8,9. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra per ablare le cellule della retina 10,11,12,13 e altri tessuti 8. Insieme, questi elementi consentono l’espressione mirata (rpe65a) di una metodologia di ablazione cellulare inducibile (NTR/MTZ)8,9 e di un marcatore fluorescente (eGFP) per la visualizzazione.

Esistono anche altri interessanti modelli in vivo che possono essere utilizzati per studiare il potenziale rigenerativo dell’RPE14. Questi sono ampi e includono la transdifferenziazione RPE-retina post-retinectomia negli anfibi, in cui le cellule RPE perse per ricrescita retinica vengono sostituite15,16; Ripristino RPE post-infortunio nel topo MRL/MpJ “super curativo”17; e stimolazione esogena della proliferazione RPE in un modello di ratto di RPE spontanea e degenerazione retinica18, tra gli altri. Sono stati sviluppati anche modelli in vitro, come le cellule staminali RPE umane adulte (RPESC)19. Questi modelli sono tutti strumenti preziosi che lavorano per scoprire i processi cellulari legati alla rigenerazione RPE (ad esempio, proliferazione, differenziazione, ecc.); tuttavia, il pesce zebra è unico nella sua capacità di riparazione RPE intrinseca post-ablazione.

Mentre la metodologia qui è scritta per concentrarsi sulla comprensione dei meccanismi che guidano la rigenerazione RPE, la linea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) e questo protocollo di ablazione genetica potrebbero essere utilizzati per studiare altri processi cellulari come l’apoptosi RPE, la degenerazione RPE e l’effetto della lesione RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti. Il protocollo di ablazione può anche essere modificato per includere la manipolazione farmacologica, che è una comoda strategia preliminare per schermare le vie di segnalazione di interesse. Ad esempio, il blocco della via Wnt canonica utilizzando l’inibitore della risposta Wnt-1 (IWR-1)20, ha dimostrato di compromettere la rigenerazione RPE3. Questo è stato ripetuto qui per guidare gli utenti attraverso un esperimento di manipolazione farmacologica e servire come proof-of-concept per convalidare uno script MATLAB (RpEGEN) creato per quantificare la rigenerazione RPE basata sul recupero della pigmentazione. Come la linea transgenica e il protocollo di ablazione, gli script RpEGEN sono adattabili e potrebbero essere utilizzati per quantificare altri marcatori / processi cellulari all’interno dell’RPE.

Protocol

Tutte le metodologie qui descritte sono conformi all’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università di Pittsburgh. 1. Preparazione prima della raccolta degli embrioni di zebrafish Impostare l’incubatrice embrionale a 28,5°C. Preparare una soluzione madre 25x dell’inibitore della melanogenesi, N-feniltiourea (PTU)21,22. Questa soluzione madre è scalata da una ricetta …

Representative Results

È noto che l’inibizione della via di segnalazione canonica Wnt compromette significativamente la rigenerazione RPE del pesce zebra utilizzando il paradigma di ablazione genetica (rpe65a:nfsB-eGFP) e la metodologia di manipolazione farmacologica (IWR-1) descritti nel protocollo3. Questo esperimento è stato ripetuto qui per convalidare un metodo automatizzato per quantificare la rigenerazione RPE del pesce zebra basato sulla pigmentazione. I risultati riassunti di seguito comprendevano tu…

Discussion

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l’RPE e studiare i meccanismi di degenerazione e rigenerazione nel pesce zebra di età larvale. Questo protocollo è stato eseguito con successo anche nel pesce zebra adulto3 ma con una caratterizzazione meno estesa, motivo per cui le larve sono al centro dell’attenzione. Gli aspetti critici di questa parte del protocollo (fasi 1-4) includono: 1) aggiunta di 1,5x PTU agli embrioni prima dell’inizio della melanogenesi, 2) decorionaz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro qui descritto è stato supportato dal National Institutes of Health (RO1-EY29410 a J.M.G e NIH CORE Grant P30-EY08098 al Dipartimento di Oftalmologia); il Centro Immunotrapianto e Terapia UPMC (a L.L.L. e J.M.G.); e la Cattedra E. Ronald Salvitti in Ricerca Oftalmologica (a J.M.G.). Un ulteriore sostegno è stato ricevuto dalla Wiegand Fellowship in Ophthalmology (a L.L.L), dalla Eye & Ear Foundation di Pittsburgh e da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, New York, NY. Gli autori desiderano anche ringraziare Amanda Platt per l’assistenza tecnica e il Dr. Hugh Hammer e lo staff acquatico per l’eccellente supporto alla cura degli animali.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. 발생학. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. 발생학. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub – ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
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