JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Нитроредуктаза/метронидазол-опосредованная абляция и платформа MATLAB (RpEGEN) для изучения регенерации пигментного эпителия сетчатки рыбок данио

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает методологию генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием трансгенной модели рыбок данио. Адаптация протокола для включения модуляции сигнального пути с использованием фармакологических соединений подробно описана. Была разработана и обсуждается платформа MATLAB для количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации.

Abstract

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) находится в задней части глаза и выполняет функции, необходимые для поддержания здоровья и целостности соседних тканей сетчатки и сосудов. В настоящее время ограниченная репаративная способность RPE млекопитающих, которая ограничена небольшими травмами, препятствует прогрессу в понимании регенеративных процессов RPE in vivo . Здесь представлена подробная методология, облегчающая изучение восстановления RPE in vivo с использованием рыбки данио, модели позвоночных, способной к надежной регенерации тканей. Этот протокол описывает трансгенную нитроредуктазу/метронидазол (NTR/MTZ)-опосредованную парадигму повреждения (rpe65a:nfsB-eGFP), которая приводит к абляции центральных двух третей RPE после 24-часового лечения MTZ с последующим восстановлением тканей. Основное внимание уделяется абляции RPE у личинок рыбок данио, а также изложены методы тестирования влияния фармакологических соединений на регенерацию RPE. Также обсуждается генерация и валидация RpEGEN, скрипта MATLAB, созданного для автоматизации количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации. Помимо активных механизмов восстановления RPE, этот протокол может быть расширен до исследований дегенерации RPE и реакций на травмы, а также влияния повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов, среди других клеточных и молекулярных процессов. Эта система рыбок данио имеет значительные перспективы в выявлении генов, сетей и процессов, которые управляют регенерацией RPE и механизмами, связанными с болезнью RPE, с долгосрочной целью применения этих знаний к системам млекопитающих и, в конечном счете, к терапевтическому развитию.

Introduction

Методология, описанная в настоящем описании, детализирует протокол генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием личинок рыбок данио. RPE простирается над задней частью глаза и находится между стратифицированными слоями нервной сетчатки и слоем сосудистой системы, составляющим сосудистую оболочку. Трофическая поддержка, поглощение фототоксического света и поддержание белков зрительного цикла являются лишь некоторыми из критических функций, выполняемых RPE, которые необходимы для поддержания здоровья и целостности этих смежных тканей1. Повреждения РПЭ млекопитающих поддаются исправлению, когда поражения небольшие2; однако ущерб, нанесенный более крупными травмами или прогрессирующими дегенеративными заболеваниями, является необратимым. У людей дегенеративные заболевания RPE (например, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и болезнь Штаргардта) приводят к постоянной потере зрения и, при небольшом количестве доступных вариантов лечения, снижению качества жизни пациента. Ограниченная способность RPE млекопитающих к самовосстановлению создала пробел в знаниях в области регенеративных процессов RPE. Учитывая надежную регенеративную способность рыбок данио во многих различных типах тканей, этот протокол был разработан для создания системы позвоночных in vivo для облегчения исследований внутренне регенерирующего RPE и выявления механизмов, которые управляют этим ответом. Используя парадигму абляции, описанную здесь, канонический сигнальный путь Wnt3, путь mTOR4 и иммунные ответы5 были идентифицированы как критические медиаторы регенерации RPE, вероятно, с перекрывающимися функциями.

В этой парадигме генетической абляции Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 рыбки данио экспрессируют ген нитроредуктазы бактериального происхождения (NTR/nfsB)6, слитый с eGFP под контролем энхансерного элемента RPE, rpe65a7. Абляция достигается путем добавления пролекарства, метронидазола (MTZ), в систему воды, в которой содержатся рыбки данио. Внутриклеточная активация МТЗ нитроредуктазой приводит к сшиванию ДНК и апоптозу в NTR/nfsB-экспрессирующих клетках 8,9. Эта технология была широко использована у рыбок данио для удаления клеток сетчатки 10,11,12,13 и других тканей 8. Вместе эти элементы обеспечивают целенаправленную экспрессию (rpe65a) индуцируемой методологии абляции клеток (NTR/MTZ)8,9 и флуоресцентного маркера (eGFP) для визуализации.

Существуют и другие интересные модели in vivo, которые могут быть использованы для изучения регенеративного потенциала RPE14. Они являются широкими и включают трансдифференциацию RPE-to-retina после ретинэктомии у амфибий, при которой клетки RPE, потерянные при отрастании сетчатки, заменяются15,16; Восстановление РПЭ после травмы у «супер заживляющей» мыши MRL/MpJ17; и экзогенная стимуляция пролиферации RPE в крысиной модели спонтанной RPE и дегенерации сетчатки18, среди прочих. Также были разработаны модели in vitro, такие как взрослые стволовые клетки RPE человека (RPESCs)19. Все эти модели являются ценными инструментами, работающими над выявлением клеточных процессов, связанных с регенерацией RPE (например, пролиферация, дифференциация и т. Д.); тем не менее, рыбка данио уникальна своей способностью к внутреннему восстановлению RPE после абляции.

В то время как методология здесь написана, чтобы сосредоточиться на понимании механизмов, приводящих к регенерации RPE, линия Tg(rpe65a: nfsB-eGFP) и этот протокол генетической абляции могут быть использованы для изучения других клеточных процессов, таких как апоптоз RPE, дегенерация RPE и влияние повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов. Протокол абляции также может быть модифицирован для включения фармакологических манипуляций, что является удобной предварительной стратегией для скрининга интересующих сигнальных путей. Например, было показано, что блокирование канонического пути Wnt с помощью ингибитора ответа Wnt-1 (IWR-1)20 ухудшает регенерацию RPE3. Это было повторено здесь, чтобы провести пользователей через фармакологический эксперимент манипуляции и служить доказательством концепции для проверки сценария MATLAB (RpEGEN), созданного для количественной оценки регенерации RPE на основе восстановления пигментации. Как и трансгенная линия и протокол абляции, скрипты RpEGEN адаптируются и могут быть использованы для количественной оценки других маркеров / клеточных процессов в RPE.

Protocol

Все методологии, изложенные в настоящем документе, соответствуют требованиям Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Питтсбурга. 1. Подготовка перед сбором эмбрионов рыбок данио Установите инкубатор эмбрион…

Representative Results

Известно, что ингибирование канонического сигнального пути Wnt значительно ухудшает регенерацию RPE рыбок данио с использованием парадигмы генетической абляции (rpe65a: nfsB-eGFP) и методологии фармакологических манипуляций (IWR-1), описанной в протоколе3. Этот эксперимент был п?…

Discussion

Этот протокол описывает методологию генетической абляции RPE и изучает механизмы дегенерации и регенерации у личиночных рыбок данио. Этот протокол также был успешно выполнен у взрослых рыбок данио3, но с менее обширной характеристикой, поэтому личинки находятся в центре вн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа, описанная здесь, была поддержана Национальными институтами здравоохранения (RO1-EY29410 для J.M.G и грант NIH CORE P30-EY08098 для департамента офтальмологии); Центр иммунной трансплантации и терапии UPMC (для L.L.L. и J.M.G.); и кафедра офтальмологических исследований Э. Рональда Сальвитти (дж.м.г.). Дополнительная поддержка была получена от стипендии Виганда в области офтальмологии (L.L.L.), Фонда глаз и ушей Питтсбурга и неограниченного гранта от Research to Prevent Blindness, New York, NY. Авторы также хотели бы поблагодарить Аманду Платт за техническую помощь и доктора Хью Хаммера и персонал водных видов спорта за отличную поддержку по уходу за животными.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. 발생학. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. 발생학. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub – ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Keywords: ZebrafishRetinal Pigment EpitheliumRPERegenerationNitroreductaseMetronidazoleMATLABRpEGENAblationTransgenicEGFPPTUPharmacological Treatment
check_url/kr/63658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image