Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra
Summary
Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.
Abstract
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) reside en la parte posterior del ojo y realiza funciones esenciales para mantener la salud y la integridad de los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. En la actualidad, la limitada capacidad reparadora de la EPR de mamíferos, que se limita a pequeñas lesiones, ha obstaculizado el progreso hacia la comprensión de los procesos regenerativos de EPR in vivo . Aquí, se proporciona una metodología detallada para facilitar el estudio de la reparación in vivo de RPE utilizando el pez cebra, un modelo de vertebrados capaz de regeneración de tejidos robustos. Este protocolo describe un paradigma de lesión mediada por nitrorreductasa/metronidazol transgénico (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que da como resultado la ablación de los dos tercios centrales del EPR después de 24 h de tratamiento con MTZ, con posterior recuperación tisular. Se hace hincapié en las ablaciones de EPR en larvas de pez cebra y también se describen los métodos para probar los efectos de los compuestos farmacológicos en la regeneración de EPR. También se discute la generación y validación de RpEGEN, un script de MATLAB creado para automatizar la cuantificación de la regeneración de RPE basada en la pigmentación. Más allá de los mecanismos activos de reparación del EPR, este protocolo se puede ampliar a estudios de la degeneración del EPR y las respuestas a las lesiones, así como a los efectos del daño del EPR en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes, entre otros procesos celulares y moleculares. Este sistema de pez cebra es muy prometedor en la identificación de genes, redes y procesos que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE, con el objetivo a largo plazo de aplicar este conocimiento a los sistemas de mamíferos y, en última instancia, hacia el desarrollo terapéutico.
Introduction
La metodología descrita aquí detalla un protocolo para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando larvas de pez cebra. El EPR se extiende sobre la parte posterior del ojo y reside entre las capas estratificadas de la retina neural y la capa de vasculatura que constituye la coroides. El soporte trófico, la absorción de luz fototóxica y el mantenimiento de las proteínas del ciclo visual son solo algunas de las funciones críticas que realiza el EPR que son esenciales para mantener la salud y la integridad de estos tejidos adyacentes1. El daño al EPR de mamíferos es reparable cuando las lesiones son pequeñas2; sin embargo, el daño sufrido por lesiones más grandes o enfermedad degenerativa progresiva es irreversible. En los seres humanos, las enfermedades degenerativas de EPR (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la enfermedad de Stargardt) conducen a la pérdida permanente de la visión y, con pocas opciones de tratamiento disponibles, disminuyen la calidad de vida del paciente. La capacidad limitada del EPR de mamíferos para autorrepararse ha creado una brecha de conocimiento en el campo de los procesos regenerativos del EPR. Dada la robusta capacidad regenerativa del pez cebra en muchos tipos de tejidos diferentes, este protocolo se desarrolló para establecer un sistema de vertebrados in vivo para facilitar los estudios sobre el EPR intrínsecamente regenerador y descubrir mecanismos que impulsan esa respuesta. Utilizando el paradigma de ablación descrito aquí, la vía de señalización canónica Wnt3, la vía mTOR4 y las respuestas relacionadas con el sistema inmunológico5 se han identificado como mediadores críticos de la regeneración de RPE, probablemente con funciones superpuestas.
En este paradigma de ablación genética, el pez cebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 expresa el gen6 de la nitrorreductasa derivada de bacterias (NTR/nfsB) fusionado con eGFP bajo control del elemento potenciador de RPE, rpe65a7. La ablación se logra agregando el profármaco, metronidazol (MTZ), al sistema de agua que alberga el pez cebra. La activación intracelular de MTZ por nitrorreductasa da como resultado la reticulación del ADN y la apoptosis en células que expresan NTR/nfsB 8,9. Esta tecnología ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra para extirpar células de la retina 10,11,12,13 y otros tejidos 8. Juntos, estos elementos permiten la expresión dirigida (rpe65a) de una metodología de ablación celular inducible (NTR/MTZ)8,9 y un marcador fluorescente (eGFP) para la visualización.
También existen otros modelos in vivo interesantes que se pueden utilizar para estudiar el potencial regenerativo del RPE14. Estos son amplios e incluyen la transdiferenciación de EPR a retina después de la retinectomía en anfibios, en la que las células de EPR perdidas por el recrecimiento retiniano se reemplazan15,16; Restauración de RPE post-lesión en el ratón MRL/MpJ “súper curativo”17; y estimulación exógena de la proliferación de EPR en un modelo de rata de EPR espontáneo y degeneración retiniana18, entre otros. También se han desarrollado modelos in vitro, como las células madre de EPR humanas adultas (RPESCs)19. Todos estos modelos son herramientas valiosas que trabajan para descubrir los procesos celulares relacionados con la regeneración de RPE (por ejemplo, proliferación, diferenciación, etc.); sin embargo, el pez cebra es único en su capacidad para la reparación intrínseca de RPE después de la ablación.
Si bien la metodología aquí está escrita para centrarse en la comprensión de los mecanismos que impulsan la regeneración de RPE, la línea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) y este protocolo de ablación genética podrían utilizarse para estudiar otros procesos celulares como la apoptosis de RPE, la degeneración de RPE y el efecto de la lesión de RPE en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. El protocolo de ablación también se puede modificar para incluir la manipulación farmacológica, que es una estrategia preliminar conveniente para detectar vías de señalización de interés. Por ejemplo, se ha demostrado que el bloqueo de la vía Wnt canónica mediante el Inhibidor de la Respuesta Wnt-1 (IWR-1)20 perjudica la regeneracióndel EPR 3. Esto se repitió aquí para guiar a los usuarios a través de un experimento de manipulación farmacológica y servir como prueba de concepto para validar un script de MATLAB (RpEGEN) creado para cuantificar la regeneración de RPE basada en la recuperación de la pigmentación. Al igual que la línea transgénica y el protocolo de ablación, los scripts RpEGEN son adaptables y podrían usarse para cuantificar otros marcadores / procesos celulares dentro del RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el EPR y estudiar los mecanismos de degeneración y regeneración en peces cebra de edad larvaria. Este protocolo también se ha realizado con éxito en peces cebraadultos 3 pero con una caracterización menos extensa, por lo que las larvas son el foco aquí. Los aspectos críticos de esta parte del protocolo (pasos 1-4) incluyen: 1) agregar 1.5x PTU a los embriones antes del inicio de la melanogénesis, 2) descoorizar embriones …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo descrito en este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (RO1-EY29410 a J.M.G, y NIH CORE Grant P30-EY08098 al Departamento de Oftalmología); el UpMC Immune Transplant & Therapy Center (a L.L.L. y J.M.G.); y la Cátedra E. Ronald Salvitti en Investigación en Oftalmología (a J.M.G.). Se recibió apoyo adicional de la Beca Wiegand en Oftalmología (a L.L.L), la Fundación Eye & Ear de Pittsburgh, y una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Nueva York, NY. Los autores también desean agradecer a Amanda Platt por la asistencia técnica y al Dr. Hugh Hammer y al personal acuático por su excelente apoyo para el cuidado de los animales.
Materials
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
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