Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Summary

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Abstract

La dispersión Raman estimulada (SRS) y la microscopía coherente de dispersión Raman anti-Stokes (CARS) son las tecnologías de imágenes de dispersión Raman coherente más utilizadas. Las imágenes hiperespectrales SRS y CARS ofrecen información espectral Raman en cada píxel, lo que permite una mejor separación de las diferentes composiciones químicas. Aunque ambas técnicas requieren dos láseres de excitación, sus esquemas de detección de señales y propiedades espectrales son bastante diferentes. El objetivo de este protocolo es realizar imágenes hiperespectrales SRS y CARS en una sola plataforma y comparar las dos técnicas de microscopía para obtener imágenes de diferentes muestras biológicas. El método de enfoque espectral se emplea para adquirir información espectral utilizando láseres de femtosegundo. Mediante el uso de muestras químicas estándar, se comparan la sensibilidad, la resolución espacial y la resolución espectral de SRS y CARS en las mismas condiciones de excitación (es decir, potencia en la muestra, tiempo de permanencia de píxeles, lente objetivo, energía de pulso). Los contrastes de imagen de CARS y SRS para muestras biológicas se yuxtaponen y comparan. La comparación directa de los rendimientos de CARS y SRS permitiría una selección óptima de la modalidad de imagen química.

Introduction

El fenómeno de dispersión Raman fue observado por primera vez en 1928 por C. V. Raman¹. Cuando un fotón incidente está interactuando con una muestra, puede ocurrir espontáneamente un evento de dispersión inelástica, en el que el cambio de energía del fotón coincide con una transición vibratoria de la especie química analizada. Este proceso no requiere el uso de una etiqueta química, por lo que es una herramienta versátil y sin etiquetas para el análisis químico al tiempo que minimiza la perturbación de la muestra. A pesar de sus ventajas, la dispersión Raman espontánea sufre de una sección transversal de dispersión baja (típicamente 10¹¹ más baja que la sección transversal de absorción infrarroja [IR]), lo que requiere largos tiempos de adquisición para el análisis². Por lo tanto, la búsqueda de aumentar la sensibilidad del proceso de dispersión Raman es esencial para impulsar las tecnologías Raman para obtener imágenes en tiempo real.

Una forma efectiva de mejorar en gran medida la sensibilidad de la dispersión Raman es a través de procesos coherentes de dispersión Raman (CRS), para los cuales generalmente se utilizan dos pulsos láser para excitar transiciones vibracionales moleculares ^3,4. Cuando la diferencia de energía de fotones entre los dos láseres coincide con los modos vibratorios de las moléculas de muestra, se generarán fuertes señales Raman. Los dos procesos CRS más utilizados para la obtención de imágenes son la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS)⁵. En las últimas dos décadas, los desarrollos tecnológicos han avanzado las técnicas de microscopía CARS y SRS para convertirse en herramientas poderosas para la cuantificación y elucidación sin etiquetas de los cambios químicos en muestras biológicas.

Las imágenes químicas por microscopía CARS se pueden fechar en 1982, cuando el escaneo láser se aplicó por primera vez para adquirir imágenes CARS, demostrado por Duncan et al⁶. La modernización de la microscopía CARS se aceleró enormemente después de las amplias aplicaciones de la microscopía de fluorescencia multifotónica de barrido láser⁷. Los primeros trabajos del grupo Xie utilizando láseres de alta tasa de repetición han hecho que CARS sea una plataforma de imágenes químicas de alta velocidad, sin etiquetas, para la caracterización de moléculas en muestras biológicas ^8,9,10. Uno de los principales problemas para las imágenes CARS es la presencia de un fondo no resonante, lo que reduce el contraste de la imagen y distorsiona el espectro Raman. Se han hecho muchos esfuerzos para reducir el fondo no resonante 11,12,13,14,15 o para extraer señales Raman resonantes de los espectros CARS ^16,17. Otro avance que ha avanzado mucho en el campo es la imagen hiperespectral CARS, que permite el mapeo espectral en cada píxel de imagen con una selectividad química mejorada 18,19,20,21.

La dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imagen más joven que CARS, aunque se descubrió antes²². En 2007, se informó de microscopía SRS utilizando una fuente láser de baja tasa de repetición²³. Pronto, varios grupos demostraron imágenes SRS de alta velocidad utilizando láseres de alta tasa de repetición 24,25,26. Una de las principales ventajas de la microscopía SRS sobre CARS es la ausencia del fondo no resonante²⁷, aunque otros fondos como la modulación de fase cruzada (XPM), la absorción transitoria (TA), la absorción de dos fotones (TPA) y el efecto fototérmico (PT), pueden ocurrir con SRS²⁸. Además, la señal SRS y la concentración de la muestra tienen relaciones lineales, a diferencia de CARS, que tiene una dependencia cuadrática de concentración de señal²⁹. Esto simplifica la cuantificación química y la desmezcla espectral. El SRS multicolor e hiperespectral ha evolucionado en diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, siendo el enfoque espectral uno de los enfoques más populares para la obtención de imágenes químicas ^37,38.

Tanto CARS como SRS requieren el enfoque de la bomba y los rayos láser Stokes en la muestra para que coincida con la transición vibratoria de las moléculas para la excitación de la señal. Los microscopios CARS y SRS también comparten mucho en común. Sin embargo, la física subyacente a estos dos procesos, y las detecciones de señales involucradas en estas tecnologías de microscopía tienen disparidades ^3,39. CARS es un proceso paramétrico que no tiene acoplamiento neto de energía fotón-molécula³. SRS, sin embargo, es un proceso no paramétrico, y contribuye a la transferencia de energía entre fotones y sistemas moleculares²⁷. En CARS, se genera una nueva señal a frecuencia anti-Stokes, mientras que SRS se manifiesta como la transferencia de energía entre la bomba y los rayos láser stokes.

La señal CARS satisface Eq (1)²⁸.

(1)

Mientras tanto, la señal SRS se puede escribir como Eq (2)²⁸.

(2)

Aquí, I_p, I_s, I_CARS y ΔI_SRS son las intensidades del haz de la bomba, el haz de Stokes, la señal CARS y las señales SRS, respectivamente. χ⁽³⁾ es la susceptibilidad óptica no lineal de tercer orden de la muestra, y es un valor complejo compuesto de partes reales e imaginarias.

Estas ecuaciones expresan los perfiles espectrales y la dependencia de la concentración de señal de CARS y SRS. Las diferencias en la física dan como resultado esquemas de detección dispares para estas dos tecnologías de microscopía. La detección de señales en CARS generalmente implica la separación espectral de fotones recién generados y la detección utilizando un tubo fotomultiplicador (PMT) o un dispositivo de carga acoplada (CCD); para SRS, el intercambio de energía entre la bomba y los haces de Stokes generalmente se mide mediante modulación de intensidad de alta velocidad utilizando un modulador óptico y demodulación utilizando un fotodiodo (PD) emparejado con un amplificador de bloqueo.

Aunque en los últimos años se han publicado muchos desarrollos y aplicaciones tecnológicas en los campos CARS y SRS, no se han realizado comparaciones sistemáticas de las dos técnicas CRS en la misma plataforma, especialmente para CARS hiperespectrales y microscopía SRS. Las comparaciones directas en sensibilidad, resolución espacial, resolución espectral y capacidades de separación química permitirían a los biólogos seleccionar la mejor modalidad para la cuantificación química. En este protocolo, se proporcionan pasos detallados para construir una plataforma de imágenes multimodales con modalidades hiperespectrales CARS y SRS basadas en un sistema láser de femtosegundo y enfoque espectral. Las dos técnicas se han comparado en la dirección hacia adelante para la resolución espectral, la sensibilidad de detección, la resolución espacial y los contrastes de imágenes de las células.

Protocol

1. Configuración instrumental para imágenes de CRS hiperespectrales NOTA: La generación de señal CRS requiere el uso de láseres de alta potencia (es decir, clase 3B o clase 4). Se deben abordar los protocolos de seguridad y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado en todo momento cuando se trabaja a potencias de pico tan altas. Consulte la documentación adecuada antes de la experimentación. Este protocolo se centra en el diseño de la trayectoria del …

Representative Results

Comparaciones de la resolución espectralLa Figura 2 compara la resolución espectral de la microscopía hiperespectral SRS (Figura 2A) y CARS (Figura 2B) utilizando una muestra DMSO. Para el espectro SRS, se aplicaron dos funciones lorentzianas (ver paso de protocolo 2.3) para ajustarse al espectro, y se obtuvo una resolución de 14,6 cm-1 utilizando el pico de 2.913 cm-1 . Para CARS, se u…

Discussion

El protocolo presentado aquí describe la construcción de un microscopio CRS multimodal y la comparación directa entre CARS y SRS imaging. Para la construcción del microscopio, los pasos críticos son la superposición espacial y temporal del haz y la optimización del tamaño del haz. Se recomienda utilizar una muestra estándar como DMSO antes de la imagen biológica para optimizar el SNR y calibrar los turnos Raman. La comparación directa entre las imágenes CARS y SRS revela que CARS tiene una mejor resolución e…

Materials

2D galvo scanner set	Thorlabs	GVS002
Acousto-optic modulator	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM driver	Isomet	532B-2
Data acquisition card	National Instruments	PCle 6363	Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage	Zaber	X-LSM050A
Deuterium oxide	Millipore Sigma	151882-100G
Dichroic mirror for beam combination	Thorlabs	DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation	Semrock	FF776-Di01-25×36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
Femtosecond laser system	Spectral Physics	InSightX3+
Filter for CARS	Chroma	AT655/30m
Filter for SRS	Chroma	ET980sp
Function generator	Rigol	DG1022Z
Glass rods	Lattice Electro Optics	SF-57
Half-wave plate	Newport	10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020	National Instruments		This is the image acquisition software
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI
Microscope housing	Olympus	BX51W1
Objective lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		This is the spectral fitting software
Oscilloscope	Tektronix	TBS2204B
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01
PMT detector	Hamamatsu	H7422P-40
PMT voltage amplifier	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube	Thorlabs	PBS255
Terminal block	National Instruments	BNC-2110